Chọn lọc các dòng ngô chuyển gen - Nội dung nghiên- 123docz.net

3. Nội dung nghiên cứu

3.1 Chọn lọc các dòng ngô chuyển gen

Sau khi khử trùng mẫu các hạt đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS, nuôi trong tối tạo điều kiện tốt nhất cho hạt nảy mầm. Các hạt sau khi nuôi cấy trong môi trƣờng MS khoảng 3 – 5 ngày nảy mầm cao khoảng 3 - 4 cm (Hình 3A) đƣợc tiến hành tách bỏ lá bao mầm để gây nhiễm Agrobacterium tumefacien mang gen chuyển. Chúng tôi tiến hành gây nhiễm vi khuẩn vào mô phân sinh cây ngô trong các khoảng thời gian gây nhiễm khác nhau: 2 giờ, 4 giờ và 16 giờ. Sau gây nhiễm các mô phân sinh đƣợc nuôi cấy trong tối để tạo điều kiện cho vi khuẩn tiếp tục xâm nhiễm vào mô phân sinh (Hình 3B). Sau khoảng 3 – 5 ngày đồng nuôi cấy chúng tôi chuyển các cây sang môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc các cây mang gen.

Hình 3: Chuyển cấu trúc gen pCambia2300-Ubi-Bt2 vào mô phân sinh cây non một

số dòng ngô. A: Các hạt ngô dòng H95 nảy mầm sau 3-4 ngày vào mẫu; B: mô phân

sinh dòng ngô H95 sau gây nhiễm trong môi trƣờng đồng nuôi cấy; C: các cây ngô dòng H95 sau chuyển gen phát triển bình thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc chứa kanamycin; D: các cây ngô dòng H95 sau chuyển gen chuyển sang màu trắng (bạch tạng) trong môi trƣờng chọn lọc chứa kanamycin; E: các cây ngô chuyển gen sau chọn lọc đƣợc trồng ra đất.

Khi chuyển gen vào phôi ngô D’Halluin và đồng tác giả [11] đã chọn đƣợc các cây chuyển gen trên môi trƣờng chứa 200 mg/l kanamycin. Kết quả của các tác giả cho thấy hầu hết các cây tái sinh mang gen kháng kanamycin đều phát triển bình thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc chứa kanamycin, các cây tái sinh không mang gen kháng kháng sinh thì lá chuyển sang màu trắng (bạch tạng). Đây chính là cơ sở cho chúng tôi chọn lựa các cây mang gen chuyển trong nghiên cứu này, vì trong cấu trúc chuyển gen có chứa gen đích (Bt2) và gen kháng kanamycin.

Sau 8-10 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kháng sinh kanamycin, một số cây vẫn sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng (Hình 3C), một số cây lá và thân chuyển từ màu xanh sang màu trắng (Hình 3D). Các cây có lá và thân chuyển sang màu trắng có thể kết luận là những cây không mang gen chuyển, ngƣợc lại các cây sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc có thể là những cây mang gen chuyển Bt2. Sau khi các cây bình thƣờng ra rễ tốt, chúng đƣợc chuyển ra đất để tiếp tục chăm sóc (hình 3E) và phân tích tiếp. Các cây này đƣợc xem nhƣ các cây chuyển gen khởi đầu T0.

Bảng 1: Kết quả chọn lọc các cây chuyển gen trong môi trường chọn lọc

STT Dòng ngô bố mẹ Số hạt thí nghiệm Số hạt nảy mầm Số cây non gây nhiễm Số cây trên môi trƣờng chọn lọc Số cây phát triển bình thƣờng Tỷ lệ cây phát triển bình thƣờng (cây chuyển gen) (%) 1 H95 500 495 490 490 37 7,55 2 H26 500 492 490 490 29 5,91 3 H240 500 494 490 490 12 2,44 4 H20 500 493 490 490 18 3,67

Chúng tôi thu đƣợc các cây chuyển gen T0 từ cả bốn dòng ngô H20, H26, H95 và H240. Kết quả trong bảng 1 cho thấy tỷ lệ các cây phát triển bình thƣờng (cây chuyển gen) trong môi trƣờng chọn lọc dao động từ 2,44 đến 7,55%. Tỷ lệ cho cây chuyển gen cao nhất là 7,55% ở dòng ngô H95, tỷ lệ thấp nhất là 2,44% ở dòng ngô H240. Tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ 10% của Li và đồng tác giả (2010) thu đƣợc khi chọn lọc cây chuyển gen trong 0,1% glufosinate. Sự khác nhau này có thể là do các kiểu gen ngô khác nhau trong hai nghiên cứu.

3.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR

96 cây chuyển gen T0 chọn đƣợc trên môi trƣờng chứa 200 mg/l kanamycin đƣợc chuyển ra trồng trong nhà lƣới. 82 cây sống sót (chiếm 85,42%) đƣợc tiến hành đánh số thứ tự từ 1 dến 82 để thu mẫu lá tách chiết DNA tổng số. Các DNA sau tách chiết đƣợc điện di trên gel agarose 1%.

Hình4: Kết quả tách DNA tổng số các dòng ngô sống sót sau chọn lọc cây chuyển gen.M: DNA marker 1 kb. 1-8: các cây sống sót đƣợc đánh số từ 1 đến 8.

DNA tổng số

Các mẫu DNA sau tách chiết đƣợc điện di kiểm tra thu đƣợc các băng vạch có kích thƣớc phù hợp, băng gọn, có thể sử dụng để kiểm tra sự có mặt của các gen Bt2 bằng PCR và lai Southern.

DNA tổng số của 82 cây T0 đƣợc PCR kiểm tra sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2. DNA của các cây dòng T0 mang gen sẽ cho băng có kích thƣớc khoảng 1,5 kb sau khi điện di trên gel agarose 1%. Hình 5 là kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2 trên các dòng cây T0.

Hình 5: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Bt2 trong một số cây ngô chuyển gen

bằng PCR với mồi đặc hiệu. M: DNA marker 1 kb; 1: Đối chứng dƣơng (DNA

plasmid); W: cây không chuyển gen; 3-14: các cây ngô chuyển gen kiểm tra: trong đó 4, 5, 7, 10, 14 là các dòng chuyển gen có mang gen Bt2 từ H26 (4, 5), H95 (7, 10) và H240 (14).

Từ hình 5 chúng tôi nhận thấy có một số cây chuyển gen mang các đoạn gen có kích thƣớc 1,5 kb phù hợp với kích thƣớc đoạn gen chuyển. Sau khi đánh giá 82 cây chuyển gen đời T0 chúng tôi đã thu đƣợc 22 cây chuyển gen dƣơng tính. Trong đó có 12 cây từ dòng H95, 7 cây từ dòng H26, 3 cây từ dòng H240. Không có cây nào từ dòng H20 cho kết quả dƣơng tính. Qua đây chúng tôi có thể nhận xét rằng các cây cho kết quả dƣơng tính sau khi kiểm tra bằng PCR là các cây có mang gen Bt2 cần chuyển, các cây cho kết quả âm tính không mang gen Bt2. Các dòng cây chọn lọc vẫn sinh trƣởng phát triển bình

thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc nhƣng lại cho kết quả âm tính khi kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu Bt2, Ubi. Điều này có thể lý giải rằng: trong quá trình chuyển gen vào mô phân sinh, cấu trúc gen chuyển vào cây bị đứt gãy chỉ có đoạn gen kháng kháng sinh chọn lọc đƣợc chuyển vào cây, còn đoạn gen đích không đƣợc chuyển vào. Vì vậy mà cây không mang gen mà vẫn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chọn lọc.

DNA tổng số của 82 cây T0 đƣợc tiếp tục kiểm tra sự có mặt của gen

Ubi bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự nhƣ UbiF/UbiR promoter. DNA của các dòng cây T0 mang gen sau khi PCR bằng mồi đặc hiệu UbiF và UbiR sẽ cho các băng có kích thƣớc khoàng 2 kb sau khi điện di trên gel agarose 1%. Hình 6 là kết quả điện di sản phẩm PCR DNA tổng số của các dòng cây T0 với cặp mồi đặc hiệu UbiF và UbiR.

Hình 6: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Ubi trong một số cây ngô chuyển gen

bằng PCR với mồi đặc hiệu. M: DNA marker 1 kb; 1: Đối chứng dƣơng (DNA

Từ hình 6 chúng tôi nhận thấy có một số cây chuyển gen mang các đoạn gen có kích thƣớc 2 kb phù hợp với kích thƣớc đoạn gen chuyển. Sau khi đánh giá 82 cây chuyển gen đời T0 chúng tôi cũng thu đƣợc 22 cây chuyển gen

dƣơng tính. So sánh kết quả đánh giá gen Bt2 và Ubi, chúng tôi thấy rằng cả 22 cây mang gen Bt2 đều mang gen Ubi. Trong đó có 12 cây từ dòng H95, 7 cây từ dòng H26, 3 cây từ dòng H240. Không có cây nào từ dòng H20 cho kết quả dƣơng tính. Qua đây chúng tôi có thể nhận xét rằng các cây cho kết quả dƣơng tính sau khi kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu UbiF và UbiR cho kết quả tƣơng đƣơng với sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2F và Bt2R. Điều này chứng tỏ sự có mặt của vector chuyển gen và gen đích trong các cây chuyển gen T0. Các cây dƣơng tính nhận đƣợc sau khi kiểm tra gen Bt2 và Ubi bằng PCR sẽ đƣợc coi nhƣ các dòng cây chuyển gen trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern

22 dòng cây T0 dƣơng tính sau khi kiểm tra gen Bt2 bằng PCR đƣợc tiếp tục đánh giá bằng lai Southern. DNA tổng số của các dòng cây chuyển gen đƣợc cắt bằng enzyme SacI, thấm truyền lên màng lai và lai với đoạn gen Bt2. DNA tổng số đƣợc cắt bằng enzyme SacI cho ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau. Đoạn DNA mang gen đƣợc nhận biết khi lai với đoạn gen Bt2 đƣợc gắn đầu dò và phát hiện trên màng lai. Kết quả cho thấy các dòng cây chuyển gen nghiên cứu có từ 1 đến 3 bản sao. Hình 7 là kết quả lai Southern một số dòng cây chuyển gen. Trên hình 7 có thể thấy dòng số2 (từ H240) có 1 bản sao, dòng số 3 và 4 (từ H95) có 2 bản sao và dòng số 5 (từ H26) có ba bản sao.

Hình 7: Kết quả kiểm tra Southern một số dòng ngô chuyển gen;

1. Đối chứng âm (cây chƣa chuyển gen), 2 – 5 . Các dòng chuyển gen từ H240 (2), H95 (3,4) và H26 (5).

Từ 22 dòng cây T0 dƣơng tính sau phân tích gen Bt2 bằng PCR, sau khi kiểm tra bằng lai Southern đã nhận đƣợc 17 dòng chuyển gen từ 3 dòng ngô bố mẹ H26, H95 và H240 mang gen Bt2. Số lƣợng cây chuyển gen và số bản sao gen chuyển đƣợc trình bầy trong bảng 2.

Bảng 2: Số dòng cây chuyển gen và số bản sao gen chuyển thu đƣợc từ mỗi dòng ngô.

Số bản sao gen

Số dòng cây mang gen Bt2 ở các dòng ngô bố mẹ

H26 H95 H240

1 2 4 1

2 3 3 0

3 1 3 0

Tổng 6 10 1

Hiệu suất chuyển gen (%)*

1,22 2,04 0,20

*Hiệu suất chuyển gen được tính bằng tỷ lệ cây chuyển gen mang gen Bt2 nhận được từ mỗi dòng sau kiểm tra Southern trên số cây non xử lý chuyển gen của

dòng đó.

Qua bảng 2 có thể thấy các 7 dòng cây chuyển gen có 1 bản sao gen chuyển, 6 dòng có 2 bản sao và 4 dòng có 3 bản sao. Số dòng chuyển gen nhận đƣợc dao động từ 1 đến 10 dòng. H95 có 10 dòng mang gen chuyển chiếm 2,04%; dòng H26 có 6 dòng mang gen chuyển chiếm 1,22%; dòng H240 có 1 dòng mang gen chuyển chiếm 0,2%. Kết quả nhận đƣợc cho thấy dòng ngô H95 cho hiệu suất chuyển gen cao hơn cả so với các dòng ngô nghiên cứu khác. So sánh hiệu suất chuyển gen của nghiên cứu so với nghiên cứu khác trên thế giới chúng tôi nhận thấy kết quả nghiên cứu của chúng tôi là chƣa cao. Với cùng đối tƣợng nghiên cứu là mô phân sinh: Li N và cộng sự có hiệu suất chuyển gen là 10%. Đối tƣợng nghiên cứu là phôi non: Ombori và cộng sự có hiệu suất chuyển

gen là 1.4%; Vega và cộng sự: 12% - 18%; Ishida và cộng sự: 50% A188, 15% A634, H99 và W117.

Kết quả đánh giá sự có mặt của gen Bt2 trong các dòng ngô bằng PCR và lai Southern cũng cho thấy thời gian gây nhiễm tốt nhất cho chuyển gen vào các dòng ngô sử dụng mô phân sinh và A. tumefaciens là 16 giờ (Bảng 3). Ở thời gian gây nhiễm 2 giờ không nhận đƣợc cây chuyển gen nào.

Bảng 3: Số lƣợng dòng cây chuyển gen theo các khoảng thời gian gây nhiễm khác nhau

STT Thời gian gây

nhiễm (giờ) Dòng ngô

Số mô phân sinh xử lý (mô) Số dòng mang gen Tỷ lệ (%) 1 2 H26 166 0 0 H240 165 0 0 H95 165 0 0 H20 166 0 0 2 4 H26 166 2 1,2 H240 166 0 0 H95 165 3 1,82 H20 166 0 0 3 16 H26 166 4 2,41 H240 166 1 0,6 H95 165 7 4,24 H20 166 0 0

Từ những kết quả nhận đƣợc có thể thấy chuyển gen vào cây ngô bằng sử dụng mô phân sinh và vi khuẩn A. tumefaciens là hoàn toàn khả thi. Thời gian tạo cây chuyển gen chỉ còn khoảng một tháng và có thể tiến hành không phụ thuộc vào mùa vụ. Trong công trình này, các mô phân sinh từ cây non 3 –

4 ngày tuổi đƣợc sử dụng, các cây chuyển gen đƣợc chọn lọc trong hai tuần: tuần đầu trên môi trƣờng chứa 100 mg/l kanamycin, tuần thứ hai trên môi trƣờng có 200 mg/l kanamycin và chỉ chọn các cây hoàn toàn bình thƣờng đã cho kết quả tốt. Tuy nhiên, để có hiệu quả cao hơn, cần có những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải tiến phƣơng pháp này với việc sử dụng các chủng A. tumefaciens và các kiểu gen ngô khác nhau kết hợp với tối ƣu hóa thời gian đồng nuôi cấy, kích thƣớc mô phân sinh và việc chọn lọc ban đầu các cây chuyển gen để tránh hiện tƣợng khảm.

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ