3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern
Các cây chuyển gen T0 dƣơng tính sau khi kiểm tra sự có mặt của gen
Bt2 bằng PCR đƣợc tiến hành kiểm tra bằng lai Southern theo hƣớng dẫn của kit K0661 của fermantas. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Điện di sản phẩm cắt DNA bằng enzyme giới hạn
DNA tổng số đƣợc xử lý với các enzyme giới hạn SacI trƣớc khi điện di chuyển màng. Gel sử dụng chuyển màng là gel agarose 1% kích thƣớc 10x7 cm, điện di trong đệm TBE 1X ở hiệu điện thế là 20 V trong 8 giờ, mỗi giếng tra 15 µl mẫu. Sau đó, marker đƣợc cắt đem nhuộm trong ethidium bromide trong khoảng 10 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh. Phần gel còn lại chứa các mẫu sẽ đƣợc làm biến tính trƣớc khi chuyển lên màng.
21
Chuyển DNA từ gel lên màng
Gel chứa DNA phải đƣợc làm biến tính trƣớc khi chuyển màng. Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel đƣợc giữ trong dung dịch đệm TBE 1X. Các bƣớc biến tính gel đƣợc thực hiện trên máy lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng. Đầu tiên, xử lý gel với 50 ml dung dịch HCl 0,25 N trong 15 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất vô trùng, sau đó gel tiếp tục đƣợc xử lý bằng 50 ml dung dịch đệm biến tính trong 30 phút. Gel đƣợc rửa bằng nƣớc cất vô trùng trƣớc khi trung hoà bằng 50 ml dung dịch đệm trung hòa. Bƣớc này cũng đƣợc tiến hành trong 30 phút, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, khay nhựa, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
Khay đƣợc đổ đầy dung dịch SSC 20X, bên trong khay có 1 tấm nhựa đƣợc đặt làm cầu. Giấy lọc đƣợc phủ lên trên tấm nhựa làm cầu, 2 đầu giấy lọc nhúng chìm trong dung dịch SSC 20X. Làm ƣớt đều giấy lọc bằng dung dịch SSC 20X, sau đó đặt gel agarose lên trên giấy lọc, mặt trên để úp xuống phía dƣới. Hệ thống chuyển màng đƣợc sắp sếp nhƣ sau: gel - màng nilon - giấy lọc (2-3 miếng). Bọt khí nằm giữa các lớp này đƣợc loại bỏ bằng que thuỷ tinh. Một lớp giấy thấm dày đƣợc đặt lên phía trên của hệ thống, và cuối cùng đặt 1 tấm nhựa lên trên cùng, phía trên chặn 1 quyển sách nhỏ để giữ hệ thống và tạo lực mao dẫn. Hệ thống chuyển màng kéo dài qua đêm ở nhiệt độ phòng.
* Làm khô và cố định DNA trên màng
Sau 16 giờ, toàn bộ DNA trên gel đƣợc chuyển toàn bộ lên màng. Màng đƣợc lấy khỏi hệ thống và đƣợc rửa trong dung dịch SSC 2X trong 10 phút, làm khô ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. DNA đƣợc cố định trên lớp màng bằng cách chiếu đèn UV với cƣờng độ 365 nm trong 20 giây.
* Chuẩn bị mồi dò gắn biotin
Mồi dò có gắn biotin đƣợc chuẩn bị trong ống 1,5 ml với các thành phần sau: 10 μl sản phẩm gen Bt2 tinh sạch, 10 μl Decanucleotide in 5X Reaction Buffer, cho thêm nƣớc khử nuclease đến 44 μl. Lắc đều, ly tâm 3 – 5 giây cho mẫu không bám dính vào thành ống. Ủ trong nƣớc sôi 5 – 10 phút, làm lạnh ngay trong đá, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu xuống dƣới đáy ống. Tiếp tục bổ
22
sung các thành phần sau vào trong ống: 5 μl Biotin label mix, 1 μl Klenow fragment exo (5 u). Trộn đều, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu, ủ mẫu ở 37oC trong 20 giờ. Phản ứng đƣợc dừng bằng cách bổ sung 1 μl 0,5 M EDTA, pH 8.
* Lai Southern
Biến tính DNA tinh dịch cá hồi bằng cách ủ ở 100oC trong vòng 5 phút, làm lạnh ngay trong đá 2 phút và bổ sung vào dung dịch tiền lai cho tới nồng độ 50 – 100 μg/ml. Dung dịch lai (0,2 ml/cm2 màng) đƣợc làm nóng đến 42oC. Sau đó đặt màng lai vào trong khay chứa dung dịch, lắc đều ở 42o
C trong 4 giờ.
Đổ bỏ dung dịch tiền lai, thay bằng dung dịch lai đã bổ sung DNA tinh dịch cá hồi và DNA gắn đầu dò (nồng độ tinh dịch cá hồi là 100 μg/ml và DNA gắn đầu dò 100 ng/ml), ủ mẫu ở 42oC qua đêm, lắc nhẹ. Rửa lại màng lai 2 lần trong dung dịch SSC 2X + SDS 0,1 % trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, và 2 lần trong dung dịch SSC 0,1X + SDS 0,1 % trong 30 phút ở 60oC. Đổ bỏ dung dịch, dùng giấy lọc làm khô màng lai.
* Phát hiện
Các đoạn DNA trên màng có tƣơng tác với mẫu dò sẽ hiện trên màng thông qua việc sử dụng kit dò. Các bƣớc hiện màng cũng đƣợc thực hiện trên máy lắc ở nhiệt độ phòng (rửa, ủ mẫu). Màng lai trƣớc tiên đƣợc rửa với 30 ml dung dịch Blocking/Washing 1X trong 5 phút. Tiếp đến, rửa lại màng lai với 30 ml dung dịch Blocking 1% trong 30 phút. Ủ màng lai với 20 ml dung dịch streptavidin – Alkaline phosphatase 1X trong 30 phút. Rửa lại màng lai 2 lần với 60 ml dung dịch Blocking/Washing 1X trong 15 phút. Ủ màng lai trong 20 ml dung dịch hiện 1X trong 10 phút. Ủ màng lai trong bóng tối với 10 ml cơ chất đã pha loãng, phản ứng enzyme giữa alkaline phosphatase với BCIP/NBT (5 – Bromo – 4 – Chloro – 3 – idolyl phosphate, p-toluidine salt/Nitro Blue Tetrazolium) sẽ tạo ra màu ở vị trí mà DNA tƣơng tác với mẫu dò. Kết thúc quá trình hiện màu, màng đƣợc rửa lại bằng nƣớc deion 2 lần, làm khô ở nhiệt độ phòng và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.
23
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN