Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi aceton.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu nhƣng khó tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ÷ (- 20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 12g. Dịch lọc aceton tiếp tục đƣợc cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 3g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 15g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 30%.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu đến tan, sản phẩm tan hoàn toàn trong dung môi MeOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ÷ (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc bằng phễu lọc thủy tinh, hút khô sản phẩm thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 33g. Dịch lọc MeOH đƣợc cô bớt dung môi tiếp tục đƣợc kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 8g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu cho đến tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ÷ (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 18g. Dịch lọc EtOH tiếp tục đƣợc kết tinh lại sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 6g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 24g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 48%.
- Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lƣợt đƣợc hoà tan trong các dung môi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, hút khô nhận đƣợc tinh thể metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Nhƣ vậy, metformine hydrochloride đƣợc kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết khoảng 99,8% ( đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp HPLC-MS).
3.3. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride. hydrochloride.
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội
Ngiên cứu trên cơ thể : chuột nhắt trắng, cả hai giống đực và cái, cơ thể khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18–22g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Chuột đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu, đƣợc nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng sản xuất, uống nƣớc tự do.
Chuột đƣợc cân để xác định trọng lƣợng và đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt đƣợc uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 900mg/kg thể trọng đến 2100mg/kg thể trọng, uống 3 lần trong 24 giờ, mỗi lần uống cách nhau ít nhất 2 giờ.
Theo d i tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo d i tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau khi uống thuốc, ở những lô dùng thuốc với liều thấp dƣới 900mg/kg thể trọng, chuột có giảm hoạt động, run nhƣng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt động bình thƣờng, đi ngoài phân khô. Ở những lô chuột uống thuốc thử liều cao, chuột giảm vận động, run r rệt, tai và đuôi tím tái, phân nhão. Từ liều 1100mg/kg trở lên có chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuột chết trong vòng 72 giờ đƣợc trình bày nhƣ bảng
LST
T Liều d ng (mg/kg) Số chuột/lô Số chuột chết T lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100
Bảng 1: Bảng kết quả thử độc tính cấp của metformin hydrochloride
Từ bảng kết quả , xây dựng đƣợc đồ thị về mối tƣơng quan giữa liều dùng và số chuột chết nhƣ sau:
Hình 3: Đồ thị về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết
Với R2 0,9776 đã cho thấy hai đại lƣợng này có mối tƣơng quan tuyến tính, do đó ta có thể sử dụng phƣơng trình y 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 = 1540mg/kg.
Nhƣ vậy ta có thể đi đến kết luận:
Độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg