2.5.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo trên máy đo trên máy Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ – Viện hóa học – Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.
2.5.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên máy Impact 410 – Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
2.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu đƣợc đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO và TMSlà chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân – Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên LC – MSD – Trap – SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2.6. Tổng hợp Metformin hydrochloride. H3C N HN NH2 CH3 NH NH .HCl 1 2 3 1'
Hỗn hợp của dimethylamine hydrochloride (50g; 0,61mol) và dicyano diamide (51,5g; 0,61mol) đƣợc đun trực tiếp ở nhiệt độ 140oC trong 6h nhận đƣợc sản phẩm thô dạng đông đặc màu trắng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc làm lạnh bằng nƣớc đá đƣa về nhiệt độ phòng. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trong dung môi thích hợp thu đƣợc sản phẩm sạch metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
Sản phẩm là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 225-2260C.
1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,91 (6H, s, 2x CH3).
13C-NMR (125MHz, DMSO), δ (ppm): 160,0 (C-3); 158,3 (C-2); 37,4 (2CH3).
EI-MS : m/z: [M-HCl]+ = 129
CTPT: C4H11N5.HCl
2.7. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride.
Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
2.8. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride. hydrochloride.
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc thử: chất metformin hydrochloride ở dạng bột trắng, hòa tan trong nƣớc cất.
Động v t thực nghiệm
Chuột nhắt trắng, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18–22g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Chuột đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu, đƣợc nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng sản xuất, uống nƣớc tự do.
Chuột đƣợc cân để xác định trọng lƣợng và đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
Phương pháp nghiên cứu.
Xác định LD50 của metformin hydrochloride trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon .
2.9. Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC-MS) HPLC-MS)
Xây dựng đƣờng chuẩn metformine hydrochloride: Cân 2mg metformin hydrochloride chuẩn đƣợc pha loãng trong MeOH với các nồng độ nhƣ sau: 2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.2mg/ml, 0.1mg/ml.
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O: MeOH= 35:65
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tổng hợp metformine hydrochloride.
Tổng hợp metformine hydrochloride theo phƣơng pháp của Shapiro [1] (sơ đồ 3.1) trong điều kiện không dung môi. Từ 1 mol dicyano diamide và 1 mol dimethyl amine hydrochloride trộn lẫn với nhau đƣợc đun ở nhiệt độ: 140oC trong 6h. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc kết tinh trong dung môi metanol nhận đƣợc metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
H2N C H2N N C N H3C NH. HCl H3C H3C N H3C C NH NH C NH NH2 + .HCl dicyano diamide (a) dimethylamine hydrochloride (b) metformin hydrochloride (c),h=70% 6h 1400C
\
Hình 1: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất metformin hydrochloride xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu ở δH 2,91 ppm (6H, s,) đặc trƣng cho proton ở 2 nhóm CH3.
Hình 2: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride.
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng của 4 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm metyl ( CH3) tại δC (ppm) 37,4 ( C-1 và C-1’ ); 2 nhóm amin C-NH2 tại δC (ppm) 160,0 (C-3), và 158,3 (C-2).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 129 [M- HCl]+ (C4H11N5.HCl).
3.2. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride.
Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi aceton.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu nhƣng khó tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ÷ (- 20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 12g. Dịch lọc aceton tiếp tục đƣợc cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 3g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 15g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 30%.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu đến tan, sản phẩm tan hoàn toàn trong dung môi MeOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ÷ (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc bằng phễu lọc thủy tinh, hút khô sản phẩm thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 33g. Dịch lọc MeOH đƣợc cô bớt dung môi tiếp tục đƣợc kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 8g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu cho đến tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ÷ (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 18g. Dịch lọc EtOH tiếp tục đƣợc kết tinh lại sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 6g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 24g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 48%.
- Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lƣợt đƣợc hoà tan trong các dung môi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, hút khô nhận đƣợc tinh thể metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Nhƣ vậy, metformine hydrochloride đƣợc kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết khoảng 99,8% ( đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp HPLC-MS).
3.3. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride. hydrochloride.
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội
Ngiên cứu trên cơ thể : chuột nhắt trắng, cả hai giống đực và cái, cơ thể khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18–22g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Chuột đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu, đƣợc nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng sản xuất, uống nƣớc tự do.
Chuột đƣợc cân để xác định trọng lƣợng và đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt đƣợc uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 900mg/kg thể trọng đến 2100mg/kg thể trọng, uống 3 lần trong 24 giờ, mỗi lần uống cách nhau ít nhất 2 giờ.
Theo d i tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo d i tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau khi uống thuốc, ở những lô dùng thuốc với liều thấp dƣới 900mg/kg thể trọng, chuột có giảm hoạt động, run nhƣng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt động bình thƣờng, đi ngoài phân khô. Ở những lô chuột uống thuốc thử liều cao, chuột giảm vận động, run r rệt, tai và đuôi tím tái, phân nhão. Từ liều 1100mg/kg trở lên có chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuột chết trong vòng 72 giờ đƣợc trình bày nhƣ bảng
LST
T Liều d ng (mg/kg) Số chuột/lô Số chuột chết T lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100
Bảng 1: Bảng kết quả thử độc tính cấp của metformin hydrochloride
Từ bảng kết quả , xây dựng đƣợc đồ thị về mối tƣơng quan giữa liều dùng và số chuột chết nhƣ sau:
Hình 3: Đồ thị về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết
Với R2 0,9776 đã cho thấy hai đại lƣợng này có mối tƣơng quan tuyến tính, do đó ta có thể sử dụng phƣơng trình y 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 = 1540mg/kg.
Nhƣ vậy ta có thể đi đến kết luận:
Độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg
3.4. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC.
Định lƣợng metformin hydrochloride bằng HPLC sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O: MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Liều (mg/kg) Số
chuột chết
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min) 0,00 65 0,01 4,00 65 0,01 5,00 65 0,3 30 65 0,3
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm excel nhƣ chỉ ra ở hình sau đây. Nồng độ (mg/ml) Diện tích Pic 2 5393.66 0,4 1027,07 0,2 515,55 0,1 19,97
Phƣơng trình đƣờng chuẩn:
Y= 0.000372*X
Trong đó: Y là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); X là diện tích pic metformin hydrochloride (mg/ml).
Xác định nồng độ Metformin: Cân 0,8mg chất cần phân tích, hòa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2115,1(mg/ml).Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0,8mg/ml. Nhƣ vậy, mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.
KẾT LUẬN
1. Đã nghiên cứu tổng hợp metfomine hydrochloride bằng phƣơng pháp của Shapiro:Ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimetyl amine hydrochloride, kết quả cho thấy khi ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimethyl amine ở nhiệt độ 1400C trong khoảng thời gian 6h nhận đƣợc metfomin hydrochloride với hiệu suất cao 70%.
2. Đã nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride trong các dung môi aceton, metanol, etanol. Kết quả cho thấy kết tinh trong metanol cho hiệu suất cao nhất 82%.
3. Đã tiến hành nghiên cứu xác định độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride, cho giá trị LD50= 1540mg/kg.
4. Đã phân tích đƣợc hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC kết quả cho thấy mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Tạ Văn Bình, Stephen Colargiuri và cộng sự (2004), Phòng và quản lý bệnh đái tháo đường tại Việt Nam-Phần 2 , NXB Y Học,tr. 8-9, 12-13,17. 2. Trƣơng Phƣơng và Ngô Quốc Huy (2006), “ Tạp chí Dƣợc học ”, tr. 264, 11-13.
Tiếng Anh.
3. Alimova IN, Liu B, Fan Z, et al (2009), “ Metformin inhibits breast cancer cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vitro’’, Cell Cycle 26:8 .
4. Bentefrit, F. và các cộng sự (1997) , “ J. Inorg. Biochem ’’, 68, 53-59. 5. http://www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/ANS00627.html "FDA Approves New Diabetes Drug "
6. Hadad SM, Appleyard V, Thompson AM (2009) “ Therapeutic
metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model ’’, Breast Cancer Res Treat 114:391.
7. Hadad SM, Fleming S, Thompson AM ,Targeting AMPK (2008), “ A new
therapeutic opportunity in breast cancer ’’, Crit Rev Oncol Hematol 67:1–7 . 8. Kristiina, M. và các cộng sự (2009), “ J. Med. Chem’’, 52, 4142-4118. 9. Pamela, A. và các cộng sự (2009) , “ Metformin in breast cancer time of action ’’, J. Clin. Oncology, 27, 1-3.
10. Phoenix KN, Vumbaca F, Claffey KP (2009), “Therapeutic
metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model ’’, Breast Cancer Res Treat 113:101–111.
11. Rao, N. K. và các cộng sự (2007) , “ JASA ’’, 3, 43-45.
12. Shapiro, S. L.Parrino, V. A. Freedman (1959), “ L. J. Am. Chem. Soc ’’,
81, 3728.
13. Shalmashi A (2008),“ New Route to Metformin Hydrochloride (N, N- dimethylimidodicarbonimidic diamide hydrochloride) Synthesis’’, Molbank , M564.
14. Stambolic V, Woodgett JR, Fantus IG, et al (2009) , “ Utility of metformin in breast cancer treatment, is neoangiogenesis a risk factor ’’, Breast Cancer Res Treat 114:387–389.
15. Zakikhani, M. và các cộng sự (2006), “ Metformin is an AMP kinase- dependent growth inhibitor of breast cancer cells ’’, Cancer Res, 66, 10269- 10273.
PHỤ LỤC