2. Thực nghiệm và kết quả
2.4.5. Nghiên cứu Flavonoid
2.4.5.1. Chiết xuất Flavonoid toàn phần:
Cho 25g bột dược liệu vào túi giấy lọc, đặt túi giấy lọc vào bình Soxhlet, chiết bằng 200ml CHC13 cho đến khi dịch chiết trong bình trọng suốt. Túi bã dược liệu được lấy ra và để bay hơi hết chloroform. Sau đó tiếp tục chiết bằng 200 ml methanol trong bình Soxhlet cho tới khi dịch chiết trong bình trong suốt và không cho phản ứng với NaOH 0,1N. Dịch chiết Methanol đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cho tới cắn. Hoà tan hoàn toàn cắn trong một lượng tối thiểu Ethanol tuyệt đối. Rót từ từ dung dịch này vào aceton, đồng thời khuấy nhẹ. Saponin tủa, lọc tủa thu được Saponin toàn phần. Dịch lọc đem cô tới cắn. Hoà tan cắn vào nước nóng. Lọc loại tạp. Dịch lọc cho vào bình gạn, chiết bằng Ethyl acetat nhiều lần cho tới khi lớp nước không cho phản ứng Cyanidin. Gộp dịch chiết Ethyl acetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn Flavonoid toàn phần.
Quy trình chiết xuất được tóm tắt bằng sơ đồ 2 ( trang 31).
2A .S 2. Kiểm tra cắn Flavonoid toàn phần bằng phản ứng hoá học:
Hoà tan cắn Flavonoid vào cồn 90° để tiến hành phản úng hoá học.
❖ Phản ứng Cyanidin:
Cho vào ống nghiệm nhỏ lml dịch cồn, thêm một ít bột Mg kim loại, nhỏ thêm vài giọt HC1 đặc, thấy dung dịch có màu đỏ đậm .
( phản ứng dương tính).
❖ Phản ứng với kiềm:
Nhỏ một giọt dịch cồn lên giấy lọc, để khô tự nhiên. Hđ tờ giấy lọc lên miệng lọ amoniac đặc đẩ mở nút thấy màu vàng của vết đậm lên.
( phản úng dương tính).
❖ Phản ứng với thuốc thử A1C13:
Cho vào ống nghiệm lml dịch cồn, thêm 3 giọt dung dịch AICI3 3% trong cồn thấy màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt. ( phản ứng dương tính).
❖ Phản ứng với thuốc thử FeCl3:
Cho vào ống nghiệm lml dịch cồn, thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa màu xanh đen.
( phản ứng dương tính).
❖ Quan sát hiện tượng tạo bọt ( Kiểm tra xem có lẫn Saponin hay không): Cho vào ống nghiệm 5ml nước cất, thêm 3 giọt dịch cồn, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều thẳng đứng trong 15 giây, quan sát thấy
\
có ít bọt tạo thành nhưng bọt tan nhanh sau 5 phút. ( phản ứng âm tính).
Nhận xét: Cắn Flavonoid thu được không có lẫn Saponin.
2.4.5.3. Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá Trà hoa Dormoy:
Cân chính xác khoảng 25 gam bột dược liệu đẵ xác định độ ẩm. Chiết xuất theo sơ đồ 2 ( Trang 31). cắn Flavonoid toàn phần thu được đem sấy ở 50°c
tới khối lượng không đổi. Cân cắn và tính ra hàm lượng Flavonoid toàn phần theo công thức:
a
F% = ---X ìbo
M( 100% - x%) Trong đó:
F: hàm lượng Flavonoid toàn phần, a : khối lượng cắn Flavonoid toàn phấn M: lượng dược liệu đem cân
X : đ ộ ẩm của dược liệ u .
Bảng 9: Kết quả định lượng Flavonoid toàn phần bằng phựơng pháp cân. STT Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm (%) Khối lượng Flvonoid ( g) Hàm lượng Flavonoid( %) 1 25,2874 9,42 1,9469 8,50 2 25,0267 9,42 1,8194 8 , 0 2 3 25,0112 9,42 1,7807 7,86 4 25,0791 9,42 1,8405 8 , 1 0 Trung bình 8 , 1 2 ± 0 , 8 6 %
Kết quả định lượng được tính theo phương pháp thống kê với mức ý nghĩa p= 0,05 cho hàm lượng Flavonoid toàn phần là 8 , 1 2 ± 0,86 %.
2A.5.4. Định tính Flavonoid toàn phần bằng SKLM:
-Dịch chấm sắc ký: Hoà cắn Flavonoid toàn phần đẫ chiết ở trên trong Methanol để chấm sắc ký.
-Bản mỏng: Silicagen GF9 5 4 (Merck) tráng sẵn. -Hệ dung môi khai triển:
Hệ V II I : CHC13-Ethylacetat- HCOOH (3:8:2) Hệ IX: Ethylacetat- H C 00H -H 20 (8:1:1 )
Hệ X: Toluen-Ethylacetat- HCOOH-MeOH( 5:6:3:1,5)'
Hệ XI: Chloroform- n Buthanol- acid formic (5: 2: 1,5). Thuốc thử hiện màu: NH3 và soi dưới đèn tử ngoại.
- Kết quả: Hệ dung môi VIII tách tốt nhất. Phát hiện vết Flavonoid dưới ánh sáng thường và quan sát dưới đèn tử ngoại, sau đó hơ NH3 và quan sát dưới ánh sáng thường và dưới đèn tử ngoại ở bước sóng X = 254 nm.
Hệ VIII: tách được 9 vết hiện màu với thuốc thử NH3.( Kết quả được thể hiện ở sắc ký đồ hình 6 và bảng 1 0 ) .
Hệ IX , hệ X tách được 9 vết.
Hệ XI tách được 7 vết hiện màu với thuốc thử NH3.
Bảng 10: Kết quả định tính Flavonoid bằng SKLM vói hệ dung môi VIII
Thứ tự vết
Rrx 100 Màu chưa phun thuốc thử Màu ph,un thuốc thử n h3/ u v. Kích thước vết ánh sáng thường u v 1. 9,64 Vàng Vàng Vàng nâu + 2. 16,87 Vàng Vàng + 3. 22,89 Vàng Vàng nâu + 4. 28,92 Vàng Vàng Vàng + 5. 36,14 Vàng Vàng đậm Vàng đậm +++ 6. 42,17 Vàng xanh Vàng xanh + 7. 51,81 Vàng Vàng \ ++ 8 . 56,63 Vàng Vàng đậm Vàng đậm ++ 9. 73,49 Vàng Vàng Vàng ++ Ghi chú: (+): vết có kích thước nhỏ, màu sắc nhạt.
(++): vết có kích thước lớn hơn, màu sắc đậm hơn. (+++): vết có kích thước lớn nhất, màu sắc đậm nhất.
Nhận xét: Qua kết quả SKLM cho thấy có 9 vết chất hiện màu với hơi NH3
trong đó có vết số 5 ,vết số 8 và vết số 9 là đậm và lớn nhất.
2A.5.5. Phân lập Flavonoid trong lá Trà hoa Dormoy bằng sắc ký cột:
Sử dụng Flavonoid toàn phần để tiến hành phân lập.
❖ Chuẩn bị cột:
Chất nhồi cột là Silicagel 60 ( Merck) cỡ hạt 0,015 - 0,040 mm. Cột có kích thước 1,8 X 40 cm.
\\
Silicagel được nhồi vào cột theo phương pháp nhồi cột ướt. Flavonoid toàn phần được trộn YỚi một lượng Silicagel thành bột khô tơi, đưa lên bề mặt cột sau đó phủ nhẹ lên trên một lớp mỏng Silicagel.
❖ Rửa giải cột.
+ Dùng dung môi Chlorform và tăng dần độ phân cực bằng Methanol ở các tỷ lệ 99:1,98:2, 97:3,...
+ Hứng dịch rửa giải lần lượt vào các ống nghiệm nhỏ đẫ được đánh số, mỗi ống 1,5 ml. Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM vớì hệ dung môi Chloroform: Ethyl acetat: Acid formic (1,5: 4: 1) thấy từ ống số 72-99 thu được 1 vết trên sắc ký đồ được ký h iệ u la TH2.
❖ Tinh chế TH2:
Gộp các ống nghiệm có cùng một vết TH2 trên sắc ký đồ, sau đó để bay hưi lự nhiên ihu đưực cắn. Kếl linh lại nhiều lần bằng Methanol thu được tinh thể hình kim.
+ Kiểm tra độ tinh khiết của TH2 bằng SKLM với 3 hệ dung môi VIII, X, XI đều cho 1 vết trên sắc ký đồ. Kết quả được thể hiện ở bảng 11 và ảnh sắc đồ ở hình 7. Điều đó chứng tỏ TH2 đạt độ tinh khiết cần thiết. \
Báng 11: Kết quả SKLM chất TH2 trên 3 hệ dung môi.
R,x 100 Màu chưa phun thuốc thử Màu phun thuốc thử
Hệ VIII Hệ X Hệ XI ánh sáng
thường
u v n h3/u v
70,76 74,63 69,35 Vàng Vàng đậm Vàng đậm
2.4.5.Ố Nhận dạng chất TH2:
- Chất TH2 kết tinh dạng tinh thể hình kim mảnh, màu vàng nhạt ( Hình 8 ).
Tan tốt trong Methanol, Ethanol, không tan trong ether. \
- Nhiệt độ nóng chảy: 276°c.
- Phổ tử ngoại( UV) đo trong MeOH cho Xmax ở 371,1 nm và 255,5 nm đặc trưng cho cấu trúc của khung Flavonol.
-Phổ hồng ngoại( IR) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3860,1 c m 1, 3754,3 c m 1, 3413,5 cm-'(~ V -OH), 2931,7 c m 1,
1654,9 cm'1, (~ V c=0), 1519,8 cm 1, 1461,0 cm'1, 1384,6 cm'1, 1320,0
cm-1, 1267,1
cm '1, 1167,2 cm '1, 1014,5 cm '1.
- Phổ khối( MS) cho pic( 100%): 302 mu tương ứng với công thức phân tử C1 5H1 0O7 đối chiếu với thư viện phổ trùng hợp với Quercetin 92%. Ngoài ra trong phổ khối còn xuất hiện các pic mảnh lớn hơn 302 mu( 338mu, 358 mu, 396 mu, 466 mu, 519 mu, 615 mu). Do đó chủng tôi dự đoán trong trong cấu trúc của TH2 có phần aglycol là Quercetin, còn phần đường chưa xác định rõ:
OH
'OH
Hình 8: Ảnh tinh thể TH2
Hình 6: Sắc đồ Flavonoid
toàn phần
Phần III: Kết luận và đề nghị
3.1 Kết luận:
Sau thời gian làm thực nghiệm, chúng tôi đã thu được một số kết quả
sau: '
- Về thực vật:
+ Đã mô tả đặc điểm hình thái cây Trà hoa Dormoy và đặc điểm của vị dược liệu là lá cây Trà hoa Dormoy, GS. Vũ Văn Chuyên đã định tên khoa
học là Thea dormoyana (Pierre) S ea ly ., họ Chè ( Theaceae).
+ Đã mô tả chi tiết và chụp ảnh vi phẫu lá, đặc điểm bột lá, xác định độ ẩm, độ tro toàn phần góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu.
- Về thành phần hoá học:
+ Bằng các phản ứng định tính đã xác định trong lá cây có Flavonoid, Saponin, Coumarin, Caroten, Acid amin, Đường khử, Phytosterol, Tanin và Poly saccharid.
+ Đã bước đầu nghiên cứu thành phần Saponin trong lá:
- Xác định Saponin trong dược liệu là Saponin triterpenoid.
- Xác định chỉ số bọt của Saponin là 250 trong điều kiện thí nghiệm.
- Định tính bằng SKLM phát hiện có 7 vết đặc trưng của Saponin trong dịch chiết lá.
- Sau khi thuỷ phân Saponin, đã định tính bằng SKLM cho thấy Sapogenin có 7 vết hiện màu với TT. Vanilin 1% trong cồn tuyệt đối. - Đã xác định hàm lượng Saponin toàn phần trong lá là 4,Ộ5 ± 0,35 %. + Đã nghiên cứu nhóm chất Flavonoid trong lá:
- Định tính Flavonoid bằng SKLM với các hệ dung môi VIII, IX, X, XI và xác định được trong lá có 9 vết hiện màu với thuốc thử NH3.
- Đã xác định hàm lượng Flavonoid trong lá là 8,12 ± 0,86 %.
\
- Bằng sắc ký cột đã phân lập được 1 Flavonoid tinh khiết ký hiệu là TH2.
- Căn cứ vào độ chảy, phổ ƯV, phổ IR và phổ MS chúng tôi nhận dạng TH2 là 1 Flavonoid dạng glycosid có phần aglycol là Quercetin.