2. Thực nghiệm và kết quả
2.4.4. Nghiên cứu Saponin trong lá Trà hoa Dormoy
2.4.4.1. Xác định chỉ sỏ bọt của Saponin:
Cân lg bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100 ml nước cất, đun cách thuỷ 30 phút, lọc nóng, để nguội, cho vào bình định mức
lOOml, thêm nước đến vạch cho đủ lOOml.
Lấy 10 ống nghiệm có kích thước bằng nhau( 16 X 1,6 cm) đánh số theo thứ tự từ 1 đến 1 0 và bố trí thí nghiệm theo bảng 5: Bảng 5: Thí nghiệm xác định chỉ sô bọt. STT 1 2 3 4 5 6 7 l 8 9 1 0 Dịch chiết Saponin( ml). 1 2 3 -4 5 6 7 8 9 1 0 Nước cất( ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Tổng số( ml). 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0
Dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm rồi lắc mạnh theo chiều dọc trong 15 giây, để yên 15 phút và đo chiều cao cột bọt trong các ống.
Kết quả: ống số 4 có có cột bọt cao 1 cm. Chỉ số bọt ( CSB ) tính theo công thức:
10 X V
CSB = K --- 1
' N x a
N: ống nghiệm có cột bọt cao lcm a: khối lượng dược liệu đem xác định CSB.
V: thể tích dịch chiết đem xác định CSB. K: hệ số pha loãng
10 X 100
CSB = 1 --- = 250
4 X 1
Kết luận: CSB của Saponin trong lá Trà hoa Dormoy là 250 trong điều kiện
thí nghiệm. \
2 A A .2. Chiết xuất Saponin toàn phần:
Cho 25g bột dược liệu vào túi giấy lọc, đặt túi giấy lọc vào bình Soxhlet, chiết bằng 200ml CHC13 cho đến khi dịch chiết trong bình trọng suốt. Túi bã dược liệu được lấy ra và để bay hơi hết chloroform. Sau đó tiếp tục chiết bằng 200 ml methanol trong bình Soxhlet cho tới khi dịch chiết trong bình Soxhlet trong suốt và không cho phản úng với acid sulfuric đặc. Dịch chiết Methanol đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cho tới cắn. Hoà tan hoàn toàn cắn trong một lượng tối thiểu Ethanol tuyệt đối. Rót từ từ dung dịch này vào aceton, đồng thời khuấy nhẹ. Saponin tủa, lọc tủa thu được Saponin toàn phần.
Quy trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ 2( trang 31).
2.4.4.3.Kiểm tra tủa Saponin toàn phần bằng phản ứng hoá học:
Tủa Saponin toàn phần được đem sấy nhẹ ở 50°c rồi đem thực hiện các
Ị
phản ứng:
❖ Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Hoà tan một ít tủa trong cồn. Cho vào ống nghiệm 5ml nước cất, thêm vào 3 giọt dịch chiết cồn. Lắc mạnh ống nghiệm trong 15giây theo chiều thẳng đúng thấy cột bọt bền vững sau 15phút.
❖ Quan sát hiện tượng phá huyết:
Hoà tan 0,5g tủa Saponin vào 10ml dung dịch NaCl 0,9% để làm thí nghiệm.
Nhỏ 1 giọt máu bò 2% đã loại fibrin lên lam kính, đậy lamen. Quan sát hồng cầu dưới kính hiển vi. Nhỏ lgiọt dịch Saponin ở trên vào cạnh lamen. Quan sát dưới kính hiển vi thấy hồng cầu bị vỡ ra khi dịch chiết thấm vào, dung dịch trên lam kính có màu vàng( phản ứng dương tính).
❖ Phản ứng Lierbermann-Burchard:
Hỗn hợp thuốc thử: lm l anhydrid acetic + lm l chloroform, để ở 0°c, khi sử dụng cho thêm lgiọt H ,S 04 đậm đặc.
Sơ đồ 2: Sơ đồ chiết xuất Flavonoid và Saponin.
Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít tủa Saponin, hoà tan tủa bằng Chloroform. Thêm hỗn hợp thuốc thử trên. Quan sát thấy xuất hiện màu đỏ tím và bền vững trong một thời gian( phản ứng dương tính, Saponin thuộc nhóm Saponin triterpenoid).
❖ Phản ứng Salkowski:
Hoà tan một ít tủa saponin vào lml chlorform, để nghiêng ống nghiệm, thêm từ từ lm l H2S 04 đặc theo thành ống nghiệm thấy xuất hiện một vòng màu đỏ ở mặt phân cách( phản ứng dương tính).
❖ Phản ứng Rosenthaler:
Hoà tan tủa Saponin trong cồn, thêm 2-3 giọt thuốc thử Vanillin 1% trong cồn và một giọt H-,S04 đặc thấy xuất hiện màu đỏ( phản ứng dương tính).
❖ Phản ứng Cyanidin: ( Kiểm tra xem có lẫn Flavonoid hay không).
Hoà tan tủa Saponin trong cồn 90°, thêm một ít bột Mg kim loại, nhỏ vài giọt HC1 đặc rồi đun cách thuỷ trong vài phút không thấy xuất hiện màu đỏ( phản ứng âm tính).
Nhận xét: Từ các phản ứng nói trên chứng tỏ tủa Saponin chiết được là Saponin tri terpenoid và không có lẫn Flavonoid.
2.4.4.4. Định lượng Saponin toàn phần trong lá Trà hoá' Dormoy bằng phương pháp cân:
Cân chính xác khoảng 25 g bột dược liệu đã xác định độ ẩm, chiết xuất theo sơ đồ 3( trang 31). Tủa Saponin toàn phần thu được đem sấy ở 60° c tới khối lượng không đổi. Cân tủa và tính ra hàm lượng Saponin toàn phần theo công thức: b s% = _____________ X 100 M (100% - x%) Trong đó: \ 32
S: hàm lượng Saponin toàn phần, b: khối lượng Saponin toàn phần. M: lượng dược liệu đem cân.
X : đ ộ ẩ m của dược liệu. '
Mỗi mẫu dược liệu được làm 4 lần, kết quả định lượng Saponin toàn phần trong lá được ghi trong bảng 6 .
Bảng 6: Kết quả định lượng Saponin toàn phần.
STT Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm (%) Khối lượng Saponin (g) Hàm lượng Saponin (%) 1 25,2874 9,42 1,0566 4,61 2 25,0267 9,42 1,0404 4,58 3 25,0112 9,42 1.0421 4,60 4 25,0791 9,42 1,0966 1 4,82 Trung bình 4,65± 0,35%
Kết quả định lưựng được tính theo phương pháp thống kê với mức ý nghĩa p =0,05 cho hàm lượng Saponin toàn phần trong lá là 4,65 ± 0,35%. 2.4.4.5. Định tính Saponin toàn phần bằng SKLM:
❖ Dịch chấm sắc ký: Hoà tan tủa Saponin toàn phần trong Me-OH làm dịch chấm sắc ký.
❖ Bản mỏng : Silicagel GF2 5 4 ( Merck) đã tráng sẩn. ❖ Hệ dung môi khai triển:
Hệ I: n Bu-OH: acid acetic: H20 (4 : 1: 1) Hệ II: CHC13: Me-OH: H20 ( 60: 40: 10) Hệ III: EtOAc: HCOOH: H20 ( 4: 1: 0,5 ).
Hệ IV: n-hexan: EtOAc: HCOOH (1: 3,5: 1).
\
❖ Thuốc thử hiện màu: dung dịch Vanillin 1 % trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đậm đặc. Sau khi phun thuốc thử, sấy ở 110°c trong lOphút. Quan sát dưới ánh sáng thường.
❖ Kết quả :
Hệ I và hệ II tách tốt hơn cả.
Hệ I: Tách được 7 vết hiện màu với thuốc thử.
Hệ II: Tách được 7 vết hiện màu với thuốc thử. I
Kết quả SKLM Saponin toàn phần được-ghi ở bảng 7 và sắc ký đồ hình 4.
Bảng 7: Kết quả định tính Saponin bằng SKLM Hệ I Vết sô 1 2 3 4 5 6 7 đậm độ + +++ +++ ++ + + + Rfx 100 13,41 26,83 36,58 51,22 61,00 69,51 73,17 Màu sắc Vàng xám Xanh đen Xanh đen Xám Xám Xám Xám Hệ II Rf X 100 9,09 14,54 43,63 47,27 54,54 61,81 8 0 , 0 0
Màu sắc Xanh Xanh Tím đỏ Xanh Vàng l Xanh Xanh
Nhận xét: Kết quả định tính bằng SKLM cho thấy có ít nhất 7 vết hiện màu với thuốc thử Vanillin 1% trong cồn.
2.4.4.6.Định tính Sapogenin bằng SKLM:
a) Thuỷ phân Saponin:
Lấy 0,5g Saponin thô thuỷ phân với 50ml HC1 7% trong bình cầu có ống sinh hàn hồi lưu trong 10 giờ. Lấy dịch thuỷ phân ra để nguội, trung hoà bằng NaOH 10% đến pH = 7 rồi cho vào bình gạn lắc với Diethyl ether. Lấy riêng lớp ether rồi cho bay hơi đến khô thu được 0,09 g cắn Sapogenin thô.
b) Định tính Sapogenin bằng SKLM:
❖ Dịch chấm sắc ký: hoà tan cắn Sapogenin trong MeOH làm dịch chấm sắc ký.
❖ Bản mỏng : Silicagel GF2 5 4 ( Merck) tráng sẩn đã hoạt hoá ở 110°c trong lgiờ.
❖ Hệ dung môi khai triển: Hệ V : EtOAc: Diethyl ether ( 4 :1 )
Hệ VI: EtOAc: Diethyl ether: Et-OH ( 5: 4 : 1) Hệ VII: CHC13: M e-OH(19: 1)
ro Thuốc thử hiện màu: dung dịch Vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đậm đặc.
Sau khi phun thuốc thử, sấy ở 110° c trong 10 phút. Quan sát dưới ánh sáng thường. Kết quả định tính Sapogenin bằng SKLM được ghi ở bảng 8 và sắc ký
đồ hình 5. I Bảng 8: Kết quả định tính Sapogenin bằng SKLM. Thứ tự vết Hệ V Hệ VI Hệ VII Rf X 100 Màu khi phun thuốc thử Rfxl00 Màu khi phun thuốc thử Rfxl00 Màu khi phun thuốc thử
1 36,36 Xanh 41,67 Xanh 6,06 Xanh nhạt
2 51,51 xanh 50,00 Tím đỏ 27,27 Xanh nhạt
3 56,06 Xanh tím 56,67 Xanh 3,33 Xanh
4 6 6 , 6 6 Xanh nhạt 60,00 Xanh 46,97 l Xanh
5 78,78 Xanh 66,67 Vàng 60,60 Xanh
6 87,87 Vàng nhạt 70,00 Xanh 78,78 xanh
7 93,93 đỏ tím
Nhận xét: Qua kết quả SKLM cho thấy có ít nhất 7 vết chất hiện màu với thuốc thử Vanillin 1% trong cồn tuyệt đối.
Hình 4: sắc đồ Saponin toàn phần