4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
2.2.2.2. Xác định hàm lượng glycin betain
(Theo Grieve và Grattan, 1983, theo mô tả của tác giả Nguyễn Văn Mã và CS, 2013) [7].
* Thiết bị, vật liệu:
-Chuẩn bị Kali tri-iot: lấy 15,7g Iot và 20g kali iot hòa tan trong 100ml nước cất và bảo quản ở tủ 4o
C. -Chuẩn bị H2SO4 2N. * Cách tiến hành:
-Lấy mẫu lá nghiền nhỏ thành dạng bột bằng cối chày sứ với nitơ lỏng. Cân 0,5g bột nghiền nhỏ hòa vào 20ml nước đề ion, đặt vào máy lắc trong 24 giờ ở 25oC.
-Lọc thu dịch, bảo quản trong tủ đá để phân tích. -Pha loãng dịch lọc bằng H2SO4 2N với tỷ lệ 1 : 1.
-Lấy 0,5ml dịch sau pha loãng cho vào ống eppendorf 2ml, đặt vào hộp đá trong 60 phút.
24
-Sau đó bổ sung 0,2ml dung dịch kali tri - Iôt, đặt hỗn hợp phản ứng này vào nhiệt độ 0 – 4oC trong 16 giờ.
-Sau đó ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 00
C.
-Hút phần dịch nổi (chú ý thao tác nhẹ nhàng) cho vào ống nghiệm, bổ sung 9ml 1,2-diclometan (đã làm mát ở -100C), đảo đều trong khoảng 1 - 2 phút (luôn giữ hỗn hợp phản ứng ở 4oC).
-Sau 2 - 2,5 giờ, bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365nm.
-Hàm lượng của glycin betain được tính toán từ đường chuẩn.
Việc tính hàm lượng glycin betain dựa theo đường chuẩn của Incharoensakdi A, 1999 và công thức sau:
Đường chuẩn glycin betain (Nguyễn Văn Mã và CS, 2013) [7] Y = 0,865.X – 0,348 (R2 = 0,97)
Trong đó: Y - nồng độ glycin betain (µg/ml), X - OD365nm. ) g ( w . 1000 df ). ml ( V ). ml / g ( Y ) g / mg ( betain Glycin Trong đó:
X: giá trị OD365nm của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml 1,2- diclometan); df: hệ số pha loãng (trong trường hợp này là 80 = 40ml dịch chiết đã pha loãng bằng H2SO4 2N/0,5ml phân tích); w: khối lượng mẫu (= 0,5g); 1000: hệ số chuyển đổi đơn vị µg/g sang mg/g mẫu).
Nồng độ glycin betain được chuẩn bị ở 50 - 200µg/ml trong axit H2SO4
1N để dựng đường chuẩn.