4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
1.4.3. Vai trò của glycin betain với thực vật trong điều kiện hạn
Đã có nghiên cứu về việc sử dụng các hợp chất hóa học để giảm bớt ảnh hưởng của hạn hán trên thực vật. Ví dụ, ứng dụng của glycin betain lên lá khoai tây và cà chua (Lycopersicum exulentum Mill.). Chỉ có thể sử dụng nó để làm giảm thất bại trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu của cây tại Sudan. Ứng dụng bên ngoài của glycin betain trên cây cũng được sử dụng trong điều kiện in vitro. Ứng dụng glycin betain bổ sung ngoại sinh trên cây bông tăng cường sức sống cây giống, nảy mầm và năng suất trong bông [32].
19
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống đậu tương DT 51 do Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Đậu đỗ Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. DT 51 được chọn tạo bằng con đường lai hữu tính. Giống được công nhận tạm thời, và hiện đang được đưa vào sản xuất thử nghiệm trong vùng Đồng bằng, trung du Bắc bộ trong 3 vụ Hè, Đông và Xuân. Đậu tương DT 51 nhiễm nhẹ đến trung bình những bệnh hại chính, chống đổ khá.
Giống đậu tương DT 51 có thời gian sinh trưởng trung bình 89 - 95 ngày. Giống đậu tương DT 51 có thể cho năng suất từ 25 - 27 tạ/ha, thậm chí một số vùng thâm canh tốt có thể đạt 29 tạ/ha. Tuy nhiên, để phát huy hết hiệu quả và năng suất của giống nên gieo trồng đúng thời vụ và với mật độ trung bình từ 30 - 40 cây/m2
.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, cây được trồng trong chậu kích thước 20 cm x 30 cm, chế độ chăm sóc được đảm bảo đồng đều giữa các chậu. Thực hiện 3 thí nghiệm ở thời điểm ra hoa.
- Thí nghiệm 1 (xử lý nhiệt độ thấp): bằng cách đặt các chậu cây vào buồng khí hậu nhân tạo (E800, AXYOS, Úc) ở 5o
C (theo phương pháp của Lê Trần Bình và cộng sự, 1998) [1].
- Thí nghiệm 2 (xử lý mặn): sử dụng NaCl 1,5% (w/v), tưới liên tục mỗi ngày (theo Jeong - Dong Lee và cộng sự, 2008) [19].
- Thí nghiệm 3 (xử lý hạn): gây hạn nhân tạo bằng cách sử dụng nilon che các chậu thí nghiệm (theo phương pháp của Lê Trần Bình và cộng sự, 1998) [1].
20
2.2.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu nghiên cứu
Trước khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành thu mẫu lá để đo hàm lượng prolin, glycin betain ở ngày đầu tiên (công thức đối chứng - ĐC), sau đó tiến hành đo các chỉ tiêu này các ngày 1, 2, 3, 4 (CT1, CT2, CT3, CT4) sau xử lý ở cả 3 thí nghiệm.
2.2.2.1. Xác định hàm lượng prolin trong mô thực vật
(Theo Bates và CS, 1973, theo mô tả của tác giả Nguyễn Văn Mã và CS 2013) [7]. Prolin có vai trò điều hòa thẩm thấu, bảo vệ trao đổi chất chống lại điều kiện stress, điều hòa pH tế bào chất, lưu trữ cacbon và nitơ, chức năng chống oxy hóa.
* Nguyên tắc thí nghiệm:
Dựa trên phản ứng giữa prolin và dung dịch ninhydrin trong axit tạo hợp chất màu vàng, hấp thụ bước sóng đặc trưng 520nm.
* Thiết bị, vật liệu:
-Axit sulphosalicylic 3% (w/v). -Axit photphoric 6M.
-Axit axetic.
-Dung dịch ninhydrin trong axit (được chuẩn bị bằng cách ủ nóng 1,25g ninhydrin trong 30ml axit axetic, và thêm 20ml axit photphoric 6M). Lưu ý: axit ninhydrin sẽ giữ ổn định chỉ trong 24 giờ, tại 4oC.
-Toluen.
* Cách tiến hành:
Ở đây chúng tôi mô tả các phương pháp định lượng prolin tự do trong các mô lá, bao gồm bốn bước chính:
21
Hình 2.1. Các bước chính của quá trình định lượng prolin tự do bằng phương pháp so màu
Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc.
Lấy 2 ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nước nóng 100oC trong thời gian 1 giờ sau đó ủ nước đá 5 phút.
Phản ứng với ninhydrin
Tách chiết
Đo quang phổ hấp thụ (520nm)
Prolin tự do
Mô lá tươi (0,25-0,50g) + 5ml axit sulphosalicylic 3%
Nghiền (bằng nitơ lỏng) Lọc (ly tâm)
Dịch lọc + 2ml dung dịch ninhydrin + 2ml axit axetic
1000C, 1 giờ
Làm lạnh: dừng phản ứng
Bổ sung: 4ml toluen Lắc đều: 15-20 giây
Đợi ở nhiệt độ phòng cho tới phản ứng có màu
Tính toán nồng độ hoặc hàm lượng (µg/g)
22
Bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem đo OD520nm bằng máy đo quang phổ.
Hàm lượng prolin được xác định dựa vào đường chuẩn prolin và tính toán theo công thức sau:
) g ( w df ). ml ( V ). ml / g ( X ) g / g ( olin Pr Trong đó:
X: giá trị OD520 của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml toluen); df: hệ số pha loãng (trong trường hợp này là 5); w: khối lượng mẫu.
* Xây dựng đường chuẩn prolin:
Tiến hành pha prolin tinh khiết ở theo các nồng độ ghi trong bảng 2.1, tiến hành phản ứng theo quy trình đã trình bày, sau đó tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 520nm trên máy UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản). Nồng độ prolin và giá trị hấp thụ OD được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nồng độ prolin và giá trị OD Nồng độ (μg/ml) OD 20 0,45 40 0,81 60 1,17 80 1,52 100 1,88
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn prolin bằng phần mềm
23 y = 0.0179x + 0.095 R² = 1 0 0.5 1 1.5 2 0 50 100 150 OD OD Linear (OD)
Hình 2.2. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn prolin
Trong đó: X - nồng độ prolin (μg/ml); Y - giá trị OD tương ứng với nồng độ X.
2.2.2.2. Xác định hàm lượng glycin betain
(Theo Grieve và Grattan, 1983, theo mô tả của tác giả Nguyễn Văn Mã và CS, 2013) [7].
* Thiết bị, vật liệu:
-Chuẩn bị Kali tri-iot: lấy 15,7g Iot và 20g kali iot hòa tan trong 100ml nước cất và bảo quản ở tủ 4o
C. -Chuẩn bị H2SO4 2N. * Cách tiến hành:
-Lấy mẫu lá nghiền nhỏ thành dạng bột bằng cối chày sứ với nitơ lỏng. Cân 0,5g bột nghiền nhỏ hòa vào 20ml nước đề ion, đặt vào máy lắc trong 24 giờ ở 25oC.
-Lọc thu dịch, bảo quản trong tủ đá để phân tích. -Pha loãng dịch lọc bằng H2SO4 2N với tỷ lệ 1 : 1.
-Lấy 0,5ml dịch sau pha loãng cho vào ống eppendorf 2ml, đặt vào hộp đá trong 60 phút.
24
-Sau đó bổ sung 0,2ml dung dịch kali tri - Iôt, đặt hỗn hợp phản ứng này vào nhiệt độ 0 – 4oC trong 16 giờ.
-Sau đó ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 00
C.
-Hút phần dịch nổi (chú ý thao tác nhẹ nhàng) cho vào ống nghiệm, bổ sung 9ml 1,2-diclometan (đã làm mát ở -100C), đảo đều trong khoảng 1 - 2 phút (luôn giữ hỗn hợp phản ứng ở 4oC).
-Sau 2 - 2,5 giờ, bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365nm.
-Hàm lượng của glycin betain được tính toán từ đường chuẩn.
Việc tính hàm lượng glycin betain dựa theo đường chuẩn của Incharoensakdi A, 1999 và công thức sau:
Đường chuẩn glycin betain (Nguyễn Văn Mã và CS, 2013) [7] Y = 0,865.X – 0,348 (R2 = 0,97)
Trong đó: Y - nồng độ glycin betain (µg/ml), X - OD365nm. ) g ( w . 1000 df ). ml ( V ). ml / g ( Y ) g / mg ( betain Glycin Trong đó:
X: giá trị OD365nm của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml 1,2- diclometan); df: hệ số pha loãng (trong trường hợp này là 80 = 40ml dịch chiết đã pha loãng bằng H2SO4 2N/0,5ml phân tích); w: khối lượng mẫu (= 0,5g); 1000: hệ số chuyển đổi đơn vị µg/g sang mg/g mẫu).
Nồng độ glycin betain được chuẩn bị ở 50 - 200µg/ml trong axit H2SO4
1N để dựng đường chuẩn.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Excel 2007 theo các tham số thống kê, kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phương
25
pháp giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với α = 0,05. Phân tích sự tương quan giữa prolin và glycin betain, biểu diễn sự tương quan bằng phương trình hồi quy tuyến tính (Nguyễn Văn Mã và cộng sự, 2013) [7] có dạng y = ax + b, y: hàm lượng glycin betain (μg/g), x: hàm lượng prolin (μg/g).
26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sự biến động hàm lượng prolin và glycin betain trong các điều kiện nhiệt độ thấp mặn và hạn nhiệt độ thấp mặn và hạn
3.1.1. Sự biến động của hàm lượng prolin trong các điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn thấp, mặn và hạn
Prolin là một amino axit được tạo ra trong thực vật và tích lũy cao trong các phản ứng với các loại stress khác nhau như mặn, hạn, nhiệt độ thấp… Prolin đóng vai trò như chất thẩm thấu ở dạng trung tính để làm ổn định protein và màng tế bào cũng như bảo tồn năng lượng khi thực vật tiếp xúc với stress. Kết quả nghiên cứu hàm lượng prolin trong các điều kiện bất lợi được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng prolin trong lá đậu tương DT 51 trong các điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn
Đơn vị: μg/g Công thức thí nghiệm Điều kiện Thí nghiệm ĐC CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 Thí nghiệm nhiệt độ thấp 0,09±0,01 a 0,32±0,04b 0,52±0,03c 0,74±0,03d 0,93±0,02e Thí nghiệm mặn (NaCl 1,5%) 0,09±0,01 a 0,39±0,02b 0,73±0,04c 1,00±0,04d 1,19±0,05e Thí nghiệm hạn 0,09±0,01a 0,19±0,02b 0,30±0,03c 0,48±0,02d 0,82±0,02e
Trong cùng một hàng, ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05
27
Hình 3.1. Sự biến động hàm lượng prolin trong lá đậu tương DT 51 trong điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn
Qua bảng 3.1 và hình 3.1 có thể thấy sự biến động của hàm lượng prolin ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau và các ngày khác nhau, cụ thể:
* Ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau:
- Ở điều kiện nhiệt độ thấp, có sự gia tăng tích lũy hàm lượng prolin từ 0,09 μg/g đến 0,93 μg/g qua 4 ngày thí nghiệm. Sự tăng hàm lượng prolin thể hiện rõ ngay từ những ngày 1 và ngày 2 (CT1, CT2) sau khi bắt đầu thí nghiệm, từ 0,09 μg/g lên 0,32 μg/g ở ngày thứ nhất và 0,52 μg/g ở ngày thứ 2, ngày thứ 3 sự gia tăng này ở mức ổn định và ngày thứ 4 thì lại tiếp tục tăng cao. Trong điều kiện nhiệt độ thấp, ở lá đậu tương có sự tăng không ngừng hàm lượng prolin, điều này phù hợp với một số nghiên cứu trước của nhà khoa học Samaras và cộng sự, 1995 [26], Taylor, 1996 [29]. Báo cáo của Van Swaaij và CS đã chỉ ra hàm lượng prolin tăng khi nghiên cứu ở lá khoai tây lai khi các cây phải chịu điều kiện lạnh [30].
Như vậy, nhiệt độ thấp có ảnh hưởng đến sự gia tăng tích lũy hàm lượng prolin trong lá đậu tương ở các công thức thí nghiệm khác nhau.
28
- Trong điều kiện mặn, ở lá đậu tương hàm lượng prolin tăng từ 0,09 μg/g đến 1,19 μg/g sau 4 ngày thí nghiệm. Qua hình 3.1 cho thấy ở tất cả các ngày đều có sự gia tăng tích lũy prolin và sự gia tăng mạnh nhất là ngày thứ 2 (CT 2), tăng 433,3 % so với ĐC. Dưới tác động stress mặn prolin được tích lũy trong thực vật và được coi như là bảo vệ, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Prolin tăng giúp chống lại sự tổn thương mô thực vật, bảo vệ tế bào, tăng khả năng chống chịu của cây. Sự tăng hàm lượng prolin để bảo vệ thực vật ở đậu tương cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây đó là dưới tác động stress mặn, prolin được tích lũy trong cả lá và mô rễ, prolin được coi như là chất bảo vệ, điều chỉnh áp suất thẩm thấu [12].
- Trong điều kiện hạn: Có thể thấy ở bảng 3.1 và hình 3.1, hàm lượng prolin tích lũy trong lá đậu tương có sự biến động, từ 0,09 μg/g đến 0,82 μg/g và có sự tăng vọt ở CT4, tăng 170,8 % so với CT3. Sự tăng mạnh này chứng tỏ lá đậu tương đã tăng cường tổng hợp prolin để chống lại điều kiện hạn kéo dài.
* Trong mỗi điều kiện khác nhau đều có sự gia tăng tích lũy hàm lượng prolin qua từng ngày. Ở từng ngày hay từng công thức thí nghiệm, hàm lượng prolin ở các điều kiện khác nhau cũng có sự biến động.
Qua bảng 3.1 và hình 3.1 thể hiện xu hướng chung là hàm lượng prolin tích lũy gia tăng nhiều ở điều kiện nhiệt độ thấp và mặn. Nhiệt độ thấp tác động mạnh mẽ tới cây đậu tương ở giai đoạn ra hoa, điều này phù hợp với nghiên cứu trước đây (theo Lê Trần Bình, Lê Thị Muội) [1]. Ở ngày thứ nhất, hàm lượng prolin trong lá ở điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn lần lượt là 0,32; 0,39; 0,19 μg/g, ở điều kiện mặn trong ngày đầu tiên sau thí nghiệm hàm lượng prolin tích lũy trong lá gấp 2,05 lần hàm lượng chất này ở lá trong điều kiện hạn và gấp 1,22 lần ở điều kiện nhiệt độ thấp. Chứng tỏ ở giống đậu tương DT 51 có phản ứng khác nhau đối với điều kiện khác nhau của môi trường và có thể điều kiện mặn có ảnh hưởng đến cây nhanh và lớn nhất trong
29
ngày đầu sau thí nghiệm. Ở điều kiện hạn, sau 1 ngày gây hạn có thể nước vẫn còn được giữ trong hệ thống keo đất nên vẫn chưa có ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển của cây do vậy mà hàm lượng prolin tích lũy còn thấp.
Qua các phân tích trên có thể kết luận:
- Có sự biến động hàm lượng prolin trong các điều kiện nhiệt độ thấp, mặn, hạn ở giống đậu tương DT 51.
- Trong các điều kiện bất lợi khác nhau thì phản ứng của cây là khác nhau, ảnh hưởng đến sự gia tăng tích lũy prolin khác nhau và đặc biệt ở điều kiện mặn có sự tác động rõ nét nhất.
3.1.2. Sự biến động của hàm lượng glycin betain trong các điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn độ thấp, mặn và hạn
Glycin betain là một chất tương thích giúp cây thích nghi với các điều kiện bất lợi của môi trường, bảo vệ tế bào chất và lục lạp. Sự tích tụ của glycin betain trong cây dưới tác động stress nước và muối đóng một vai trò quan trọng trong điều chỉnh áp suất thẩm thấu, sự gia tăng glycin betain trong thực vật được nhiều nhà khoa học xem là một phản ứng thích nghi để chống lại stress nước và độ mặn. Glycin betain đã được chứng minh để bảo vệ các màng thylakoid chống lại stress do nhiệt độ thấp.
Sự biến động của hàm lượng glycin betain trong các điều kiện nhiệt độ thấp, mặn, hạn được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2.
30
Bảng 3.2. Hàm lượng glycin betain trong lá đậu tương DT 51 trong các điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn
Đơn vị: μg/g Công thức thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm ĐC CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 Thí nghiệm nhiệt độ thấp 0,17±0,02 a 0,24±0,02b 0,37±0,02c 0,47±0,03d 0,62±0,03e Thí nghiệm mặn (NaCl 1,5%) 0,17±0,02 a 0,37±0,01b 0,50±0,02c 0,57±0,01d 0,60±0,01e Thí nghiệm hạn 0,17±0,02a 0,25±0,01b 0,34±0,03c 0,45±0,01d 0,67±0,03e
Trong cùng một hàng, ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05
Hình 3.2. Sự biến động của hàm lượng glycin betain trong lá đậu tương trong điều kiện nhiệt độ thấp, mặn và hạn
Qua bảng 3.2 và hình 3.2 ta thấy ảnh hưởng của các điều kiện bất lợi đến hàm lượng glycin betain, có sự biến động hàm lượng glycin betain ở các điều kiện khác nhau và qua các ngày thí nghiệm khác nhau, cụ thể là:
31 * Ở các điều kiện khác nhau:
- Ở điều kiện nhiệt độ thấp, có sự gia tăng tích lũy hàm lượng glycin betain từ 0,17 μg/g đến 0,62 μg/g. Ở ngày đầu tiên sau thí nghiệm lượng glycin betain tăng ít, tăng lên 0,24 μg/g, tăng nhiều nhất ở ngày thứ 2 sau thí nghiệm (CT2), tăng 154,2% so với ngày thứ nhất (CT1), tuy nhiên con số tăng lên vẫn còn thấp, cho thấy tác động của nhiệt độ thấp đến sự tổng hợp glycin betain là chưa lớn cũng như tác động đến cây đậu tương chưa nhiều. Hàm lượng glycin betain tiếp tục tăng ổn định ở các ngày tiếp theo.
- Ở điều kiện mặn, sự biến động hàm lượng glycin betain từ 0,17 μg/g