3.2.4.1 Các chủng vi sinh vật dùng để thử nghiệm
Bao gồm những vi khuẩn và nấm thủ nghiệm gây bệnh ở người do ATCC cung cấp:
Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.
Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hóa như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
Lactobacillus fermentum: (Lp B14) gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có trong hệ tiêu hóa của người và động vật.
Enterococcus faecium: (B650) gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.
3.2.4.2 Môi trường nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm.
3.2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50(nồng độ ức chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
a. Pha loãng mẫu thử
Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 5 nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 μg/mL, tiếp theo là 32 μg/mL, 8 μg/mL, 2 μg/mL, 0,5 μg/mL.
b. Thử hoạt tính
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105 CFU/mL khi tiến hành thử.
– Lấy 10 μL dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200 μL dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37ºC. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
c. Chất tham khảo
Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng E.c với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2 μg/mL.
Kháng sinh Streptomycin cho chủng Pa với giá trị IC50 trong khoảng 10-15 μg/mL.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 TỔNG HỢP 1-BROMO-4-NITROBENZENE (2)
4.1.1. Điều kiện sơ bộ để tổng hợp chất 2
Hợp chất 1-bromo-4-nitrobenzene được tổng hợp theo phản ứng sau: Br HNO3, H2SO4 55 - 60oC, 15 - 20 phút Br NO2 1 2 bromobenzene 1-bromo-4-nitrobenzene Phản ứng tổng hợp 1-bromo-4-nitrobenzene
Dung dịch HNO3 đậm đặc được cho vào bình cầu đặt trong chậu đá. Sau đó cho tiếp tục dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và để cho hỗn hợp này nguội. Cho tiếp bromobenzene vào, vừa cho vừa lắc và kiểm soát nhiệt độ để không vượt quá 60ºC. Bắt hỗn hợp phản ứng lên bếp khuấy từ 20 phút ở 55ºC. Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm được chiết với EtOAc và rửa với nước và nước muối bão hòa. Để dịch chiết khô dung môi ta sẽ được sản phẩm thô. Sau đó thực hiện kết tinh lại sản phẩm thô với dung môi EtOH:H2O (95:5). Sản phẩm thu được có màu kem.
Sản phẩm kết tinh lại được giải ly trong dung môi PE, chất 1-bromo-4- nitrobenzene có Rf = 0,31.
Hình 4.2 Bản mỏng giải ly chất 2 trong dung môi PE
Khi thực hiện phản ứng cần lưu ý đến nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng. Nếu không kiểm soát được nhiệt độ thì sẽ sinh ra nhiều sản phẩm ortho- và meta-. Quá trình tạo hỗn hợp acid sulfonitric là quá trình tỏa nhiệt vì vậy cần phải để bình phản ứng vào chậu đá để hạ nhiệt độ nhanh chóng. Thêm vào đó, phản ứng tạo chất 2 cũng là phản ứng tỏa nhiệt nên khi nhỏ bromobenzene vào hỗn hợp acid sulfonitric phải thực hiện thật từ từ, có thể quá trình này sẽ mất 10-15 phút.
Về cơ chế phản ứng, phản ứng xảy ra theo cơ chế thế thân điện tử vào vòng benzene. Bromobenzene đóng vai trò là chất thân hạch còn ion nitronium đóng vai trò chất thân điện tử.
Cơ chế phản ứng được trình bày trong Hình 4.3.
HNO3 + H2SO4 O2S ONO2 OH + H3O + HSO4 O2S ONO2 OH NO2 + HSO4 HNO3 + H2SO4 NO2 + H3O + HSO4 Br N O O Br H NO2 O S O H O O Br NO2 1 2 Hình 4.3 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất 2 Rf = 0,31
4.1.2. Xác định cấu trúc sản phẩm (Phụ lục 1, Phụ lục 2)Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δppm) cho thấy: Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δppm) cho thấy:
Có hai tín hiệu mũi đa ở δH = 7,69 ppm và δH = 8,11 ppm là vùng xuất hiện của H trên vòng benzene.
Cường độ tích phân của hai mũi là 2,000 và 2,028 cho thấy hợp chất có tính đối xứng. Điều này chứng tỏ vòng benzene có hai nhóm thế ở vị trí
para- với nhau.
Tín hiệu các proton trên vòng benzene ở δH = 7,69 ppm (m, J = 7 Hz và
J = 2 Hz, 2H) và ở δH = 8,11 ppm (m, J = 7Hz và J = 2 Hz, 2H) Kết quả phổ cho thấy, hợp chất tổng hợp được có công thức như sau:
Br NO2 Br NO2 6 2 5 1
Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR của 1-bromo-4-nitrobenzene
STT Số và loại proton δ (ppm) Mũi, J (Hz)
1,6 2H, CH 7,69 m, J = 7Hz, J = 2Hz
2,5 2H, CH 8,11 m, J = 7Hz, J = 2Hz
4.1.3. Khảo sát điều kiện thực hiện phản ứng
4.1.3.1. Nhiệt độ
Kết quả khảo sát nhiệt độ của phản ứng được trình bày trong Bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát nhiệt độ của phản ứng tổng hợp p-bromonitrobenzene Nhiệt độ (ºC) Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất (%)
45 ºC 0,0210 32,1
55 ºC 0,0263 35,88
65 ºC 0,0149 22,23
Bản mỏng sắc ký dịch chiết EtOAc (vết ở giữa mỗi bản mỏng) của hỗn hợp sản phẩm ở 45ºC, 55ºC, 65ºC với hệ giải ly PE:EtOAc tỷ lệ 100:1 được trình bày ở Hình 4.4
Hình 4.4 Kết quả sắc ký bản mỏng khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo chất 2
4.1.3.2. Thời gian
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng được trình bày trong Bảng 4.3
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tổng hợp 1-bromo-4-nitrobenzene Thời gian (phút) Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất (%)
10 0,1365 42,92
15 0,1025 38,30
20 0,1098 43,85
25 0,1028 40,62
30 0,0681 24,97
Hình 4.5 Kết quả sắc ký bản mỏng khảo sát thời gian phản ứng tổng hợp chất 2
4.1.3.3. Tỷ lệ mol tác chất
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol tác chất dến phản ứng được trình bày trong Bảng 4.4
Bảng 4.4: Kết quả khảo sát tỷ lệ mol tác chất của phản ứng tổng hợp 1-bromo-4- nitrobenzene (2)
Tỷ lệ mol C6H5Br:HNO3 Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất (%)
1:1 0,0180 7,64 1:2 0,0857 36,72 1:3 0,0822 34,59 1:4 0,1219 52,06 1:5 0,1235 53,03 1:6 0,1375 59,27 1:7 0,0945 38,37 1:8 0,1123 48,30
Từ Bảng 4.4 cho thấy với tỷ lệ mol giữa bromobenzene và HNO3 là 1:6 thì phản ứng đạt hiệu suất cao nhất.
Hình 4.6 Kết quả sắc ký bản mỏng khảo sát tỷ lệ mol tác chất phản ứng tổng hợp chất 2
4.2 TỔNG HỢP 2-(4-NITROPHENOXY)NAPHTALENE (3)
4.2.1. Điều kiện sơ bộ tổng hợp chất 3
Hợp chất 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene (3) được tổng hợp theo phản ứng sau: Br NO2 OH KOH/NaOH, DMSO, 90oC, 1-2h O NO2 2 3 1-bromo-4-nitrobenzene 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene Phản ứng tổng hợp chất 3
Trong bình cầu đáy tròn 50 mL, cho KOH vào và hòa tan bằng một ít nước. Dùng pipet hút lấy DMSO cho vào bình phản ứng. β-naphtol được cân và cho tiếp vào bình cầu, lắc cho tan hoàn toàn. Cuối cùng chất 2 được cho vào bình phản ứng. Bắt bình phản ứng lên bếp khuấy từ trong 1-2h. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm được chiết với EtOAc, rửa nhiều lần với nước và nước muối bão hòa. Để dịch chiết EtOAc khô sẽ thu được sản phẩm thô. Thực hiện kết tinh lại sản phẩm thô với dung môi EtOH:H2O (95:5), sản phẩm thu được có màu vàng nâu.
Hình 4.7 Sản phẩm 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene (3)
Sản phẩm kết tinh lại được giải ly trong hệ dung môi PE:CHCl3 (7:3), chất 3 thu được có Rf = 0,47.
Hình 4.8 Bản mỏng chất 3 trong hệ dung môi PE:CHCl3 (7:3)
Về cơ chế phản ứng, phản ứng là một dạng của phản ứng tổng hợp ether Williamson (cơ chế SNAr). Cơ chế phản ứng được trình bày trong Hình 4.9
O OH H O Br NO2 O NO2 Br O NO2 Br O NO2 3 2 Rf = 0,47
4.2.2. Xác định cấu trúc sản phẩm (Phụ lục 4, Phụ lục 5) Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δppm) cho thấy: Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δppm) cho thấy:
Hai mũi đa ở δH = 7,05 ppm và δH = 8,20 ppm có dạng mũi giống với phổ chất 2, đồng thời tín hiệu proton tại δH = 7,05 (m, J = 9 Hz và J = 3,5 Hz, 2H) và tại δH = 8,20 (m, J = 9 Hz và J = 3 Hz, 2H) cho thấy la những hydro có tinh đối xứng và đây là các proton trên vòng benzene.
Mũi đa tại δH = 7,22 ppm (dd, J = 9 Hz và J = 2,5 Hz, 1H) và mũi đôi tại δH = 7,91 ppm (d, J = 9Hz, 1H) ghép spin với nhau, hai proton này nằm trên vòng naphthalene và ở vị trí ortho- với nhau.
Hai mũi đôi tại δH = 7,87 ppm (d, J = 8 Hz, 1H) và tại δH = 7,78 ppm (d, J = 8 Hz, 1H) ghép spin với mũi đa tại δH = 7,51 ppm (m, J = 8 Hz, J = 1,5 Hz và J = 1 Hz, 3H) và các proton này nằm trên vòng naphthalene.
Kết quả phổ cho thấy hợp chất tổng hợp được là 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene (3).
O
NO2
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR của 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene STT Số và loại proton δ (ppm) Mũi, J (Hz)
1 2H, CH 7,05 m, J = 9 Hz, J = 3,5 Hz 2 2H, CH 8,20 m, J = 9 Hz, J = 3 Hz 3 1H, CH 7,22 dd, J = 9 Hz, J = 2,5 Hz 4 1H, CH 7,91 d, J = 9 Hz 5 1H, CH 7,87 d, J = 8 Hz 6 1H, CH 7,78 d, J = 8 Hz 7 3H, CH 7,51 m, J = 8 Hz, J = 1,5 Hz, J = 1 Hz
4.2.3. Khảo sát điều kiện thực hiện phản ứng
4.2.3.1. Nhiệt độ
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng được trình bày từ Hình 4.10 đến Hình 4.13 (hệ dung môi giải ly PE:EtOAc = 10:1, UV 254 nm).
– Ở 50ºC: phản ứng xảy ra trong 5h. Hình 4.10 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở 50ºC – Ở 70ºC: phản ứng xảy ra trong 2h. Hình 4.11 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở 70ºC – Ở 90ºC: Phản ứng xảy ra trong 2h. Sản phẩm
Hình 4.12 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở 90ºC – Ở 100ºC: Phản ứng xảy ra trong 2h.
Hình 4.13 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở 100ºC Từ kết quả bản mỏng cho thấy ở 90°C thì phản ứng xảy ra tốt nhất, tuy ở 100°C tác chất còn ít hơn nhưng đồng thời sản phẩm phụ cũng nhiều. Ở 90°C thì phản ứng còn tác chất, điều này có thể do lượng base chưa đủ nên cần khảo sát tiếp tỷ lệ đương lượng giữa tác chất và base.
4.2.3.2. Tỷ lệ tác chất và KOH
Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tác chất và KOH đến phản ứng được trình bày từ Hình 4.14 đến Hình 4.18 (hệ dung môi giải ly PE:EtOAc = 10:1, UV 254 nm).
Hình 4.14 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở tỷ lệ chất 2:β-naphtol:KOH = 1:1:1 – Tỷ lệ 1:1:2 Hình 4.15 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở tỷ lệ chất 2:β-naphtol:KOH = 1:1:2 – Tỷ lệ 1:1:3 Hình 4.16 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở tỷ lệ chất
– Tỷ lệ 1,1:1:2 Hình 4.17 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở tỷ lệ chất 2:β-naphtol:KOH = 1,1:1:2 – Tỷ lệ 1,2:1:2 Phản ứng xảy ra trong 1h. Hình 4.18 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 ở tỷ lệ chất 2:β-naphtol:KOH = 1,2:1:2
Từ kết quả trên cho thấy ở tỷ lệ 1,2:1:2 thì phản ứng xảy ra tốt nhất. Vì khi phản ứng, sản phẩm 1-bromo-4-nitrobenzene sẽ bị thất thoát nên ở các tỷ lệ 1:1:3 và 1,1:1:2 tuy tác chất 1-bromo-4-nitrobenzene hết nhưng điều kiện chưa tốt.
Ở tỷ lệ 1,2:1:2 khối lượng sản phẩm thu được là: 0,6356 g
Vậy: 100 96,02% 6619 , 0 6356 , 0 H
4.2.3.3. Sử dụng base cho phản ứng
Sử dụng điều kiện phản ứng tốt nhất khi dùng KOH đối với trường hợp NaOH thì phản ứng xảy ra trong 2h. Cụ thể như sau:
Hình 4.19 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 3 với base NaOH Kết quả bản mỏng cho thấy khi sử dụng base NaOH thì thời gian phản ứng lâu hơn và tác chất 1-bromo-4-nitrobenzene hết trong khi tác chất β-naphtol còn.
Vậy phản ứng thực hiện tốt hơn khi sử dụng base KOH.
4.3 TỔNG HỢP 4-(NAPHTALENE-6-YLOXY)BENZENAMINE (4)
4.3.1. Điều kiện sơ bộ tổng hợp chất 4
Hợp chất 4-(naphthalene-6-yloxy)benzenamine (4) được tổng hợp theo phản ứng sau: O NO2 O NH2 100oC, 30 phút Fe/HCl EtOH, H2O 3 4 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene 4-(naphthalene-6-yloxy)benzenamine Trong một bình cầu đáy tròn 50 mL, cho vào dung dịch EtOH 99,5º, bột sắt và 2-(4-nitrophenoxy)naphthalene. Bình cầu được bắt lên bếp khuấy từ đun hoàn lưu trong khoảng 5 phút. Cho tiếp dung dịch HCl vào và hỗn hợp được đun tiếp trong 30 phút. Sau khi phản ứng kết thúc, cho vào bình cầu một ít KOH rồi đem bình cầu xuống để nguội ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp phản ứng được chiết với
kiềm hóa bằng KOH rắn và chiết với EtOAc. Cô đuổi dung môi dịch EtOAc thu được sản phẩm thô. Sản phẩm thô được kết tinh lại với dung môi MeOH:H2O
(95:5) hoặc thực hiện sắc ký cột sản phẩm thô (silica gel, PE:EtOAc:MeOH = 45:5:1) thu được sản phẩm tinh khiết có màu nâu.
Hình 4.20 Sản phẩm 4-(naphthalene-6-yloxy)benzenamine (4)
Sản phẩm kết tinh lại được giải ly trong dung môi CHCl3, chất 4 thu được có Rf = 0,6.
Hình 4.21 Bản mỏng chất 4 trong dung môi CHCl3
4.3.2. Xác định cấu trúc sản phẩm (Phụ lục 6, Phụ lục 7)
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δppm) cho thấy:
Hai mũi đôi tại δH = 6,75 ppm (m, J = 8,5 Hz và J = 2 Hz, 2H) và tại
δH = 6,95 ppm (m, J = 9 Hz và J = 2 Hz, 2H) ghép spin với nhau và là tín hiệu của các proton trên vòng benzene.
Mũi đa tại δH = 7,24 ppm (dd, J = 9 Hz và J = 2 Hz, 1H) ghép spin với mũi đôi tại δH = 7,79 ppm (d, J = 8,5 Hz, 2H) và mũi đôi tại δH = 7,16 ppm (d, J = 2,5 Hz, 1H).
Mũi đa tại δH = 7,36 ppm (m, J = 7,75 Hz và J = 1,5 Hz, 1H) ghép spin với mũi đa tại δH = 7,42 ppm (m, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz, 1H).
Mũi đôi tại δH = 7,65 ppm (d, J = 8 Hz, 1H) ghép spin với hai mũi đa tại δH = 7,36 ppm và tạ δH = 7,42 ppm.
MS m/z 236,17 (MH+), suy ra M = 235,17 đvC.
Từ các dữ kiện trên đây cho thấy hợp chất tổng hợp được có công thức như sau: O NH2 2 3 7' 5' 4' 3' 8' 2' 1' 6 5
Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 1H-NMR của 4-(naphthalene-6-yloxy)benzenamine STT Số và loại proton δ (ppm) Mũi, J (Hz)
2, 6 2H, CH 6,75 m, J = 8,5 Hz, J = 2 Hz 3, 5 2H, CH 6,95 m, J = 9 Hz, J = 2 Hz 7’ 1H, CH 7,16 d, J = 2,5 Hz 5’ 1H, CH 7,24 dd, J = 9 Hz, J = 2 Hz 8’ 1H, CH 7,65 d, J = 8 Hz 3’,4’ 2H, CH 7,79 d, J = 8,5 Hz 1’ 1H, CH 7,42 m, J = 8 Hz, J = 1,5 Hz 2’ 1H, CH 7,36 m, J = 7,75 Hz, J = 1,5 Hz
4.3.3. Khảo sát điều kiện thực hiện phản ứng
Các khảo sát dưới đây được thực hiện theo phương pháp thứ nhất.
4.3.3.1. Khảo sát tỷ lệ mol acid HCl và chất 3
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của acid HCl đến phản ứng được trình bày từ Hình 4.22 đến Hình 4.24 (hệ dung môi giải ly PE:EtOAc = 7:3, UV 254 nm).
Hình 4.22 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 4 với tỷ lệ mol acid HCl:chất 3 = 5:1
– Tỷ lệ mol acid HCl:chất 3 = 3:1
Hình 4.23 Bản mỏng theo dõi phản ứng tổng hợp chất 4