3.4.1. Định tính bằng phương pháp hoá học
Cắn của 4 phân đoạn trên được thử định tính Aavonoid và saponin (phương pháp xem mục 3.1.1 và 3.1.3), cho thấy cắn của phân đoạn EtOAc cho phản ứng của Aavonoid dương tính và rõ nhất, còn trong phân đoạn n- BuOH cho phản ứng của saponin rõ nhất. Chúng tôi nhận định sơ bộ, trong 4
phân đoạn trên thành phần Aavonoid được tập trung chủ yếu ở phân đoạn EtOAc, saponin tập trung chủ yếu ở phân đoạn n-BuOH.
Bảng 3 .3: Kết quả định tính
Cắn A Cắn B Cắn c Cắn D
Flavonoid - + +++ +
Saponin - + + +++
3.4.2. Định tính bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: hoà cắn các phân đoạn A, B, c, D đã chiết được ở trên trong methanol làm dịch chấm sắc ký.
- Dùng bản mỏng Silicagel Gp254 (Merck) tráng sẵn đã hoạt hoá ở
1 10°c trong 60 phút.
- Hệ dung môi khai triển: Toluen/EtOAc/Acid formic/H20 (6 : 5: 1,5 : 1) - Tiến hàiửi: bình sắc ký được bão hoà dung môi. Bản mỏng đã hoạt hoá, sau khi chấm mẫu được triển khai theo chiều từ dưới lên trên.
SKLM các phân đoạn
- Kết quả: Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, uv 254 nm, ư v 366 nm và hơ amoniac. cắn n-hexan cho 2 vết, cắn CHCI3 cho 6 vết, cắn EtOAc lên 10 vết, cắn n-BuOH lên 2 vết. Trong đó 5 vết trong cắn phân đoạn CHQ3 có Rf trùng vói 5 vết trong phân đoạn cắn EtOAc nhưng khồng đậm bằng.
Bảng 3.4: Sơ bộ định tính cắn các phân đoạn bằng SKLM
Vết Rf as thưòỉng
n-hexan CHC13 EtOAc n-BuOH
1 0,13 vàng 2 0,30 vàng 3 0,33 + (UV254 nm) 4 0,34 vàng 5 0,40 xám xám 6 0,41 + ịhơ NHị: mciii vàng) 7 0,46 vàng vàng 8 0,50 + ịUV 366 nm phát quang tím) 9 0,52 vàng vàng 10 0,55 vàng xanh vàng xanh 11 0,67 vàng vàng rửiạt vàng nhạt 12 0,82 + ( ư v 366 nm phát quang tím) 13 0,85 xanh xaah
(+); các vết quan sát được ở ƯV' 254 nm hoặc u v 366 nm hoặc hiện màu với NH3.
SKLM phân đoạn EtOAc
Chúng tôi quan tâm đến phân đoạn EtOAc do có phản ứng định tính flavonoid rõ nhất, các vết chấm sắc ký nhiều và đậm nhất, cắn EtOAc được định tính bằng SKLM với nhiều hệ dung môi khác nhau.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I; Toluen/Ethylacetat/Acid formic/HjO (6 : 5 : 1,5 ; 1) Hệ II: Toluen/Ethylacetat/Acid fonnic (5 : 6 : 1,5)
Hệ ni: Ethylacetat/Chloroform/Acid formic ( 4 : 1 : 1 ) Hệ IV: Ethylacetat/Acid formic/HjO ( 8 : 1 : 1 )
Hệ V: Benzen/Ethylacetat ( 9 : 1 )
Hệ VI: Toluen/Ethylacetat/MeOH ( 6 : 8 : 1 ) Hệ VH: Ethylacetat/MeOH (4 :1 )
- Kết quả: hệ dung môi I tách tốt nhất. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, ư v 254 nm, u v 366 nm, hơ amoniac, phun thuốc thử AICI3 3%
trong cồn. Kết quả được thể hiện ở sắc ký đồ hình 3.2 và bảng 3.5. Bảng 3.5: Kết quả định túứi cắn EtOAc bằng SKLM
Sl'l' Rf Đậm độ Màu sắc As thường U V 366nm A ia v as thưòíng 1 0,13 + vàng vàng đậm 2 0,30 ++ vàng nâu 3 0,34 ++ vàng vàng 4 0,40 +++ xám xám 5 0,46 +++ vàng vàng sáng 6 0,50 phát quang tún 7 0,52 + vàng vàng 8 0,55 +++ vàng xanh vàng xanh 9 0,67 ++ vàng nhạt vàng nhạt 10 0,82 phát quang tún ế I
As thường AICI3/AS U V 254nm ƯV366nm
thường
3.5. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN EtOAc3.5.1. Phân lập 3.5.1. Phân lập
Sử dụng cắn c thu được từ phân đoạn EtOAc chiết được từ lá của cây Giảo cổ lam để tiến hành phân lập.
- Chuẩn bị chất nhồi cột: Lấy khoảng 12 g Sephadex LH-20, ngâm trong methanol tuyệt đối trong 24 h cho trương nở hoàn toàn, thỉnh thoảng lắc đều.
- Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
- Dung môi rửa giải; Methanol.
- Chuẩn bị cột: Cột thuỷ tinh có khoá và nắp đậy kín, đườnơ kứih 1,8 cm, chiều dài 40 cm, rửa sạch, sấy khô, tráng cột bằng MeOH tuyệt đối. Dưới đáv cột lót một lớp bông mỏng và 1 khoanh giấy lọc. Đổ Sephadex đã ngâm tnrcfng nở vào cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Rửa sạch thành cột bằng MeOH. Sau đó để yên 1 - 2 h, thả nhẹ 2 khoanh giấy lọc tròn có đường kính bằng đường kính cột trên bê mặt Sephadex. On định cột trong 24 h.
- Tiến hành sắc ký:
Hoà tan khoảng 0,5 g cắn c bằng một lượng tối thiểu MeOH rồi đưa lên cột. Rửa giải bằng MeOH, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút. Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm 5 ml đã đánh số, mỗi ống khoảng 1 , 5 - 2 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi I cho kết quả;
+ Từ ống 48 - 54 cho một vết màu vàng. Gộp các ống này lại, cho kết tinh lại nhiều lần thu được tinh thể màu vàng sáng kí hiệu Vị.
+ Từ ống 59 - 64 cho 1 vết màu vàng nâu. Gộp các ống này lại, cho
kết tinh lại nhiều lần thu được bột mịn màu vàng kí hiệu C3.
3.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết của và C3
- Hệ I: Toluen/EtOAc/Acid formic/HjO (6 : 5 : 1,5 : 1) - Hệ II: Toluen/EtOAc/Acid formic/H2 0 ( 5 : 6: 1,5) - Hệ III: EtOAc/CHClj/Acid formic ( 4 : 1 : 1 )
Kết quả cho thấy với các hệ dung môi khác nhau, chất Vj và C3 đều cho
một vết trên bản SKLM.
Chất Vị ở 3 hệ dung môi khai triển đều cho 1 vết với Rf tương ứng là 0,55; 0,64; 0,85 (bảng 3.6 và hình 3.3).
Chất C3 ở 3 hệ dung môi khai triển đều cho 1 vết với Rf tương ứng là 0,46; 0,69; 0,80 (bảng 3.6 và hình 3.4).
Hèi Hsn Hsm
c.ì Cì c.í
Hình 33. Sắc ký đồ của Vị ữong các hệ dung môi I, II, III
Hình 3.4. Sắc ký đồ của C3 trong các hệ dung mồi I, II, III
Âií>4:ỊíV-
. ""ĩ
C3 Tp VI
u v 254nm As thường
Bảng 3.6. Kiểm tra độ tinh khiết của Y ị và C3 bằng SKLM
STT Tinh thể
Rf Màu sắc
H ệ l Hệ II H ê in As thường HƠNH4OH ALCI3/ as thường
1 0,55 0,64 0,85 Vàng xanh Vàng sẫm Vàng sáng
2 c , 0,46 0,64 0,80 Vàng Nâu Vàng sáng 3.6. NHẬN DẠNG CÁC CHẤT PHÂN LẬP Được
3.6.1. Nhận dạng
- Chất Vị dạng tinh thể hình kim mảnh màu vàng nhạt, tan tốt trong methanol, ethanol, khó tan trong chloroform.
- Phổ ư v đo trong MeOH cho đỉnh hấp thụ cực đại ^niax- 255,556 nm và 367,778 nm đặc trưng cho flavonoid có khung flavone.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp phụ mạnh ở
3280,1; 1656,5; 1619,6; 1588,8; 1509,1; 1366,7; 1338,5; 1238,5; 1158,9; 1115,7; 1040,5; 805,6 cm'^
- Phổ khối (MS) cho [M]"^ = 330 mu tưcfng ứng với công thức phân tử: C ^ H iA và các pic mảnh: 315 = 330 - CHgClS); 301 = 315 - 0(16); 259 = 287 - CO(28); 231 mu;. Tra cứu trong thư viện phổ khối chất Vj tương ứng với cấu trúc của 5,6-dimethoxy-7,3,4-trihydroxyflavone.
'5'
CH3O
OCH3O
5,6-dimethoxy-7,3,4-trihydroxyflavone - Phổ cộng hưởng từ 1 chiều (ID - NMR ‘H và NMR
+ Phổ NMR (125MHz, MeOD) cho thấy chất V, có 17 tín hiệu trong đó có 5 carbon bậc 3; không có carbon bậc 2; 2 carbon bậc 1 và 10 carbon bâc 4.
+ Dựa vào phổ NMR *H (500MHz, MeOD) chất Vj có các vị trí proton được xác định như sau:
Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR ‘H của chất Vi
STl' ỗ ppm Độ bội Số proton J(Hz) Vị trí proton
1 7,72 s 1 H3
2 7,70 dd 1 8,5; 2 H .
3 7,09 d 1 8,5 H ,
4 6,72 d 1 2 H2
5 6,36 d 1 2 Hg
Trong đó: 5: độ dịch chuyển hoá học J: Hằng số tương tác
Căn cứ vào phổ u v , IR, MS và NMR chúng tôi nhận dạng chất Vj là 5,6-dimethoxy-7,3,4'-trihydroxyflavone.
3.6.2. Nhận dạng C3
- Thể chất: C3 dạng bột màu vàng, tan tốt trong methanol, ethanol, ethylacetat, ít tan trong nước và chloroform, không tan trong ether.
- Phổ ư v đo trong MeOH cho 255,556 nm và 371,111 nm đặc trưng cho flavonoid có khung flavonol.
- Phổ IR đo trong KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3424,2 cm'*(v-OH), 1610,9 cm-‘(v c=0); 1522,4; 668,7; 480,4 cm'^
- Phổ khối MS cho [M]'*’ = 302 mu, tương ứng với công thức phân tử Ci5Hio0 7. Tra thư viện phổ C3 trùng hợp vói cấu trúc: 3, 3 , 4, 5, 7 penta hydroxy flavon (Quercetine) với độ trùng lặp 95%.
Công thức cấu tạo:
O H % 2 1 3 4 V \ = 6 O H = / 5 ■ O H Quercetine
- Phổ cộng hưởng từ 1 chiều (ID - NMR ‘H và NMR ‘^C)
+ Phổ NMR (125MHz, MeOD) và phổ DEPT 90, DEPT135 cho thấy chất C3 có 15 tín hiệu trong đó có 5 carbon bậc 3, không có carbon bậc 2, không có carbon bậc 1 và 10 carbon bậc 4.
+ Dựa vào phổ NMR (500MHz, MeOD) chất C3 có các vị trí
proton được xác định như sau:
Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của chất C3
S'1'1' ỗ ppm Độ bội Số proton J(H z) Vị trí proton
1 7,75 d 1 2,5 H ,
2 7,65 dd 1 8,5; 2 H .
3 6,90 d 1 8,5 H ,
4 6,40 d 1 2 H6
5 6 ,2 0 d 1 2 Hb
Trong đó: ô: độ dịch chuyển hoá học J: Hằng số tương tác
Căn cứ vào phổ u v , IR , MS và NMR chúng tôi nhận dạng chất C3 là
Quercetine.
3.7. BÀN LUẬN
So với kết quả nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học cây Giảo cổ lam ở Cao Bằng, chúng tôi có một số nhận xét như sau :
Định tính:
- Giống nhau: trong thành phần trên mặt đất đều có flavonoid, saponin, acid amin, acid hữu cơ, sterol.
- Khác nhau: Cây ở Cao Bằng có đường khử, cây ỏ Sapa không có đường
khử.
^ Định lượng;
- Hàm ỉượng cắn trong phân đoạn EtOAc của cây thu hái ở Cao Bằng cao hcfn cây thu hái ở Sapa.
- Ngoài định lượng cắn trong phân đoạn EtOAc và n-BuOH chúng tôi còn định lượng cả cắn trong các phân đoạn n-hexan, và chloroform, trong khi các công trình trước đây chưa quan tàm đến.
Quy trình chiết xuất các chất trong cây Giảo cổ lam thu hái ở Sapa được thực hiện theo quy trình chiết toàn phần bằng MeOH, sau đó cắn MeOH được chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-hexan, CHCI3, EtOAc đến n-BuOH thu được 4 phân đoạn khác nhau
Từ phân đoạn EtOAc đã phân lập được 2 flavonoid là Quercetine và 5,6-dimethoxy-7,3,4’-trihydroxyflvanone. Trong đó, Quercetine là chất đã được tách ra từ cây Giảo cổ lam thu hái ở Cao Bằng, còn 5,6-dimethoxy- 7,3,4 -trihydroxyflvanone là chất lần đầu tiên được phân tách ra.
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
4.1. KẾT LUẬN
Qua thời gian làm thực nghiệm chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
Bằng phương pháp hóa học đã xác định trong lá và thân cây Giao cổ lam thu hái ở SaPa đều có chứa Aavonoid, saponin, acid hữu cơ, acid amin và sterol.
Định lượng cắn các phân đoạn trong lá Giảo cổ lam; phân đoạn n-hexan là 1,54 ± 0,34% ; trong phân đoạn CHCI3 là 2,76 ± 0,4%, trong phân đoạn EtOAc là 1,52 ± 0,03%, trong phân đoạn n-BuOH là 5,3 ± 0,2%.
Định lượng cắn các phân đoạn trong thân Giảo cổ lam: phân đoạn n- hexan là ; 1,15 ± 0,14% ; trong phân đoạn CHCI3 là: 3,93 ± 0,08% ; trons phân đoạn EtOAc là 0,43 ± 0,08%, trong phân đoạn n-BuOH là 1,43 ± 0,12%. Kết quả cho thấy hàm lượng cắn trong lá cao hon hàm lượng cắn trong thân, trong đó hàm lượng cắn trong phân đoạn n-BuOH là lón nhất (5,3%).
4“ Định tính nhóm chất ílavonoid và saponin với 4 phân đoạn chiết xuất cho thấy phân đoạn EtOAc cho phản ứng dương tính rõ rệt với các thuốc thử Aavonoid và phân đoạn n-BuOH cho phản ứng dương tính rõ rệt với thuốc thử saponin. Chúng tôi kết luận đối với cây Giảo cổ lam ở Sapa, ílavonoid tập trung chủ yếu ở phân đoạn EtOAc, saponin tập trung chủ yếu ở phân đoạn n- BuOH.
^ SKLM các phân đoạn n-hexan, CHCI3, EtOAc, n -BuOH cho thấy các chất trong các phân đoạn không giống nhau, trong đó cắn EtOAc cho nhiều vết nhất (1 0 vết) và các vết đậm nhất.
4“ Từ phân đoạn EtOAc, bằng phương pháp sắc ký cột (Sephadex-LH2o) 2 chất tinh khiết Vị và C3 đã được phân lập. Căn cứ vào phổ IR, u v , MS, ‘H
NMR, NMR, DEPT và cơ sở dữ liệu WILLEY 275.L, chất Vj được nhận
dạng là 5,6-dimethoxy-7,3’,4’-trihydroxyflavone; chất C3 được nhận dạng là
Quercetine. 4.2. ĐỂ XUẤT
Do thời gian có hạn, nhíĩng nghiên cứu trên đây của chúng tôi mới chỉ là bước đầu và chỉ chú trọng đến flavonoid. Qiúng tôi có một số đề xuất:
Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hoá học trong cây Giảo cổ lam
Tiến hành nghiên cứu tác dụng sinh học các phân đoạn chiết xuất được và nghiên cứu dạng bào chế để có thể đưa vào thử lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ môn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập I, 126 - 142, 159 - 289.
2. Bộ môn Dược liệu (1998), Thực tập Dược liệu phần hoá học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Bộ môn Thực vật (2004), Thực vật Dược và phân loại thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Vũ Đức Cảnh (1999), Nghiên cứu thành phần hoá học và một s ố tác dụng sinh học của cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
Cucurbitaceae, khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học.
5. Võ Văn Chi (1997), Tií’điển cây thuốc Việt Nam, tập 2, 308, 309.
6. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, 1322, 1323. 7. Lê Văn Cường (1998), Góp phần nghiên CÍCII cây Gynostemma
pentaphylliim (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae, khoá luận tốt nghiệp
Dược sĩ Đại học.
8. Nguyễn Tiến Dẫn (1999), Nghiên cứii về thành phần hoá học và tác
dụng sinh học của cây Thất diệp đởm, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ
Dược học.
9. Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa
học và tác dụng sinh học của cây Thất diệp đản, khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ
Đại học.
10. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1980), Phương pháp nghiên cứii
hoá học cây thuốc, NXB Y học, 243 - 289, 327 - 347.
11. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển I, 563, 575.
12. Phạm Thanh Hương (2003), Nghiên cứii thành phần hoá học và một số
tác dụng sinh học của cây Giao cổ lam, khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ
Đại học.
13. Lê Khả Kế (1978), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, NXB Khoa học kĩ thuật.
14. Phan Lê (2002), Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, NXB Thuận Hoá, tập 2, 573-574.
15. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cầy thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.
Tiếng Anh.
16. The Flavonoid: Advances in Research since 1986, ơiapman and Hall, London.
17. Akihisa, Toshihừo, Tamura (1990)," 4 a - methyl sterol isolated from G.pentaphyllum", Phytochemistry, 29 (5), 1647 - 51.
18. Chen J.c. et al (1999), "Gypenoside induces apoptosis in human Hep3B and HA22T tumour cells", Cytobios, 100 (393), 37 - 48.
19. Chen J .c et al (2000)," Therapeutic effect of gypenoside on chronic liver injury and fibrosis induced by CƠ4 in rats", Am J Chin Med, 28 (2),
175 - 85.
20. Chen J .c et al (2002), " Regulation of Bcl-2 family molecules and activation of caspase sascade involved in gypenosides-induced apoptosis in human hepatoma cells". Cancer lett, 183 (2), 169 - 178. 21. Qien w .c và cộng sự al (1996), " Protective effects of Gynostemma
pentaphyllum in gamma-ừradiated mice", Am J Chin Med, 24 (1), 83 - 93. 22. Cui J., Eneroth p., Bruhn J.G. (1999),"Gynostemma pentaphyllum:
identification of major sapogenins and differentation from Panax species", Eur J Pharm Sci, 8 (3), 187 - 91.
23. Fang Z.P., Zeng X.Y. (1989),"Isolation and identification of flavonoid and organic acids from Gynostemma pentaphyllum Makino", Zhongguo
Zhong Yao Za Zhi, 14 (11), 676 - 8, 703.
24. Han M.Q., Lui J.X., Gao H. (1995)," Effects of 24 Chinese medicinal herbs on nucleic acid, protein and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell", Zhongguo Zhong Xi yi Jie He Za Zhi, 15 (3), 147 -9.