Ngâm 10 g bột dược liệu trong bình nón bằng ether dầu hoả, để qua đêm. Lọc lấy dịch, đem dịch làm các phản ứng:
Đinh tính chất béo:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết này lên 1 miếng giấy lọc để khô rồi quan sát: không thấy có vết đục mờ trên miếng giấy lọc => phản ứng âm tính.
Đinh tính caroten:
Lấy 2 ml dịch chiết ether dầu cho vào ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thuỷ tới cắn. Cho thêm 2 giọt acid sulfuric đặc vào thấy màu dung dịch không chuyển sang xanh da trời => phản ứng âm tính.
Đinh tính sterol:
Lấy 1 ml dịch chiết ether dầu hoả bốc hơi tới cắn, cho thêm 1 ml anhydrit acetic lắc kỹ. Đặt nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm từ từ 0,5 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng có vòng tím đỏ => phản ứng dương tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam có sterol, không có chất béo và không có caroten.
3.1.9. Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin
Cho 5 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước, đun cách thuỷ trong 10 phút. Lọc lấy dịch lọc đem định tính:
Dinh tính đường khử: cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT Fehling A và 3 giọt TT Fehling B. Đun cách thuỷ 5 phút, thấy trong ống nghiệm không có tủa đỏ gạch => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giáo cổ lam không có đường khử. Đinh tính acid hữu cơ:
Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho thêm một ít tinh thể NajCOj thấy bọt khí nổi lên => phản ứng dương tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam có acid hữu cơ. Đinh tính acid amin:
ƠIO 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt TT Ninhydrin 3%. Đun cách thuỷ 7 - 1 0 phút, thấy xuất hiện màu xanh tím => phản ứng dương tính.
Bảng 3 .1 : Kết quả định tính các nhóm chất trong thân và lá Giao cổ lam
{Gynostemma pentaphyllum, Cucurbitaceae) thu hái ở Sapa
STT Nhóm chất Pư đinh tíĩih Kết quả Kết
Lá Thân luận
Tạo tủa với thuốc thử 1 Alcaloid '1'1' Mayer ri' Dragendorff '1'1' Bouchadat - - Không có 2 Flavonoid Pư Cyanidin Với dd NaOH 10% Với NH3 V ớiddFea,5% +++ +++ +++ +++ + 4-+ Có Pư Liebermann - -
3 Glycosid tim Pư Baijet Pư Legal - - Không có Pư mở, đóng vòng lacton - -
4 Coumarin Vi thăng hoa - - Không
Hiện tượng huỳnh - - có
quang
Hiện tượng tạo bọt +++ 5 Saponin Hiện tượng phá
huyết
Pư phân biệt 2 loại
saponin +++ Triterpenoid +++ Triterpenoid Có
6 Anthranoid Pư Bomtrager - - Không có
7 Tanin VớiFeCl3 5% +++ + Không
Với gelatin 1% - - có
8 Acìd hữu cơ Pư với Na2C03 + + Có 9 Đưèfng khử Pư với 11' Fehling A
và '1'1' Fehling B
- - Không
có
10 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - - Không có
11 Acid amin Với 1T Ninhydrin 3%
+ + Có
12 Sterol Pư Lieberaiann + + Có
13 Caroten Pư với H2SO4 đặc - - Không có Ghi chú (-): âm tính
(+): dưcfng tính
(++): Phản ứng dương tính rõ (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Trong lá và thân cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae có flavonoid, saponin, acid hữu cơ, acid amin và sterol, trong đó flavonoid và saponin là hai nhóm chính.
3.2. QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC NHÓM CHẤT TRONG LÁ VÀ THÂNCÂY GIAO CỔ LAM CÂY GIAO CỔ LAM
Dược liệu được tán nhỏ, cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng methanol cho tới khi dịch chiết trong suốt và không cho phản ứng với NaOH 0,1N. Dịch chiết methanol thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cho tới cắn. Hoà tan cắn trong nước nóng, lọc nóng được dịch chiết nước. Đem dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, Ethylacetat, n-BuOH thu được 4 phân đoạn dịch chiết. Các phân đoạn đem cất thu hồi dung môi thu được cắn ký hiệu là A, B, c, D tương ứng.
Hình 3.1: Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết các nhóm chất trong thân và lá Giảo cổ lam
3.3. ĐỊNH LƯỢNG CẮN CÁC PHÂN ĐOẠN
Cân chúứi xác khoảng 10 g bột dược liệu đã xác định độ ẩm. ơ iiết xuất theo sơ đồ 3.1. Cắn các phàn đoạn thu được đem sấy ở 60° tới khối lượng khônơ đổi. Cân cắn và tính hàm lượng các chất trong các phân đoạn theo công thức;
a F = M x ( l - x )•xioo Trong đó: F: hàm lượng chất (%) a: khối lượng cắn (g)
M: lượng dược liệu đem cân(g) x: độ ẩm của dược liệu (%)
Mỗi mẫu dược liệu được làm 5 lần, kết quả định lượng trong lá và thân được ghi ở bảng 3.2.
Kết quả định lượng phân đoạn được tính theo phương pháp thống kê với mức ý nghĩa a = 0,05
Bảng 3. 2: Kết quả định lưcmg các phân đoạn trong lá và thân Giảo cổ lam Mẫu S'1‘1' Khối lượng (g) Hàm ẩm (%)
Cắn n-hexan Cắn CHCI3 Cắn EtOAc Cắn n-BuOH (g) (%) (g) (%) (g) (%) (g) (%) ĩ,á 1 10,934 8,75 0,133 1,33 0,285 2,85 1,56 0,505 5,06 2 10,935 8,75 0,210 2,10 0,340 3,41 ĩ Ê M ề 1,54 0,514 5,15 3 10,938 8,75 0,154 1,55 0,240 2,40 i i l i s 1,53 0,529 5,29 4 10,935 8,75 0,150 1,51 0,253 2,53 0,152 1,52 0,551 5,52 5 10,936 8,75 0,120 1,21 0,262 2,63 10,147 1,47 0,546 5,47 Tb(%) 1,54 ± 0,34 2,76 + 0,4 ịỊ,52± 0,03 5,30 ± 0,2 Thân 1 10,933 9,01 0,091 0,92 0,391 3,93 i i i i y 0,36 0,153 1,54 2 10,932 9,01 0,127 1,27 0,396 3,98 0,052 0,50 0,124 1,25 3 10,934 9,01 0,112 1,13 0,400 4,02 0,047 0,45 0,129 1,30 4 10,939 9,01 0,120 1,20 0,380 3,82 ^0,043 0,41- 0,136 1,36 5 10,932 9,01 0,121 1,22 0,390 3,92 ^ 0,049 3.“ . - - 0,46 0,124 1,24 Tb(%) 1,15 ± 0,14 3,93 ± 0,08 |ọ;43:^0,()5; 1,34 + 0,12
3.4. ĐỊNH TÍNH CẮN CÁC PHÂN ĐOẠN3.4.1. Định tính bằng phương pháp hoá học 3.4.1. Định tính bằng phương pháp hoá học
Cắn của 4 phân đoạn trên được thử định tính Aavonoid và saponin (phương pháp xem mục 3.1.1 và 3.1.3), cho thấy cắn của phân đoạn EtOAc cho phản ứng của Aavonoid dương tính và rõ nhất, còn trong phân đoạn n- BuOH cho phản ứng của saponin rõ nhất. Chúng tôi nhận định sơ bộ, trong 4
phân đoạn trên thành phần Aavonoid được tập trung chủ yếu ở phân đoạn EtOAc, saponin tập trung chủ yếu ở phân đoạn n-BuOH.
Bảng 3 .3: Kết quả định tính
Cắn A Cắn B Cắn c Cắn D
Flavonoid - + +++ +
Saponin - + + +++
3.4.2. Định tính bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: hoà cắn các phân đoạn A, B, c, D đã chiết được ở trên trong methanol làm dịch chấm sắc ký.
- Dùng bản mỏng Silicagel Gp254 (Merck) tráng sẵn đã hoạt hoá ở
1 10°c trong 60 phút.
- Hệ dung môi khai triển: Toluen/EtOAc/Acid formic/H20 (6 : 5: 1,5 : 1) - Tiến hàiửi: bình sắc ký được bão hoà dung môi. Bản mỏng đã hoạt hoá, sau khi chấm mẫu được triển khai theo chiều từ dưới lên trên.
SKLM các phân đoạn
- Kết quả: Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, uv 254 nm, ư v 366 nm và hơ amoniac. cắn n-hexan cho 2 vết, cắn CHCI3 cho 6 vết, cắn EtOAc lên 10 vết, cắn n-BuOH lên 2 vết. Trong đó 5 vết trong cắn phân đoạn CHQ3 có Rf trùng vói 5 vết trong phân đoạn cắn EtOAc nhưng khồng đậm bằng.
Bảng 3.4: Sơ bộ định tính cắn các phân đoạn bằng SKLM
Vết Rf as thưòỉng
n-hexan CHC13 EtOAc n-BuOH
1 0,13 vàng 2 0,30 vàng 3 0,33 + (UV254 nm) 4 0,34 vàng 5 0,40 xám xám 6 0,41 + ịhơ NHị: mciii vàng) 7 0,46 vàng vàng 8 0,50 + ịUV 366 nm phát quang tím) 9 0,52 vàng vàng 10 0,55 vàng xanh vàng xanh 11 0,67 vàng vàng rửiạt vàng nhạt 12 0,82 + ( ư v 366 nm phát quang tím) 13 0,85 xanh xaah
(+); các vết quan sát được ở ƯV' 254 nm hoặc u v 366 nm hoặc hiện màu với NH3.
SKLM phân đoạn EtOAc
Chúng tôi quan tâm đến phân đoạn EtOAc do có phản ứng định tính flavonoid rõ nhất, các vết chấm sắc ký nhiều và đậm nhất, cắn EtOAc được định tính bằng SKLM với nhiều hệ dung môi khác nhau.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I; Toluen/Ethylacetat/Acid formic/HjO (6 : 5 : 1,5 ; 1) Hệ II: Toluen/Ethylacetat/Acid fonnic (5 : 6 : 1,5)
Hệ ni: Ethylacetat/Chloroform/Acid formic ( 4 : 1 : 1 ) Hệ IV: Ethylacetat/Acid formic/HjO ( 8 : 1 : 1 )
Hệ V: Benzen/Ethylacetat ( 9 : 1 )
Hệ VI: Toluen/Ethylacetat/MeOH ( 6 : 8 : 1 ) Hệ VH: Ethylacetat/MeOH (4 :1 )
- Kết quả: hệ dung môi I tách tốt nhất. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, ư v 254 nm, u v 366 nm, hơ amoniac, phun thuốc thử AICI3 3%
trong cồn. Kết quả được thể hiện ở sắc ký đồ hình 3.2 và bảng 3.5. Bảng 3.5: Kết quả định túứi cắn EtOAc bằng SKLM
Sl'l' Rf Đậm độ Màu sắc As thường U V 366nm A ia v as thưòíng 1 0,13 + vàng vàng đậm 2 0,30 ++ vàng nâu 3 0,34 ++ vàng vàng 4 0,40 +++ xám xám 5 0,46 +++ vàng vàng sáng 6 0,50 phát quang tún 7 0,52 + vàng vàng 8 0,55 +++ vàng xanh vàng xanh 9 0,67 ++ vàng nhạt vàng nhạt 10 0,82 phát quang tún ế I
As thường AICI3/AS U V 254nm ƯV366nm
thường
3.5. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN EtOAc3.5.1. Phân lập 3.5.1. Phân lập
Sử dụng cắn c thu được từ phân đoạn EtOAc chiết được từ lá của cây Giảo cổ lam để tiến hành phân lập.
- Chuẩn bị chất nhồi cột: Lấy khoảng 12 g Sephadex LH-20, ngâm trong methanol tuyệt đối trong 24 h cho trương nở hoàn toàn, thỉnh thoảng lắc đều.
- Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
- Dung môi rửa giải; Methanol.
- Chuẩn bị cột: Cột thuỷ tinh có khoá và nắp đậy kín, đườnơ kứih 1,8 cm, chiều dài 40 cm, rửa sạch, sấy khô, tráng cột bằng MeOH tuyệt đối. Dưới đáv cột lót một lớp bông mỏng và 1 khoanh giấy lọc. Đổ Sephadex đã ngâm tnrcfng nở vào cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Rửa sạch thành cột bằng MeOH. Sau đó để yên 1 - 2 h, thả nhẹ 2 khoanh giấy lọc tròn có đường kính bằng đường kính cột trên bê mặt Sephadex. On định cột trong 24 h.
- Tiến hành sắc ký:
Hoà tan khoảng 0,5 g cắn c bằng một lượng tối thiểu MeOH rồi đưa lên cột. Rửa giải bằng MeOH, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút. Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm 5 ml đã đánh số, mỗi ống khoảng 1 , 5 - 2 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi I cho kết quả;
+ Từ ống 48 - 54 cho một vết màu vàng. Gộp các ống này lại, cho kết tinh lại nhiều lần thu được tinh thể màu vàng sáng kí hiệu Vị.
+ Từ ống 59 - 64 cho 1 vết màu vàng nâu. Gộp các ống này lại, cho
kết tinh lại nhiều lần thu được bột mịn màu vàng kí hiệu C3.
3.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết của và C3
- Hệ I: Toluen/EtOAc/Acid formic/HjO (6 : 5 : 1,5 : 1) - Hệ II: Toluen/EtOAc/Acid formic/H2 0 ( 5 : 6: 1,5) - Hệ III: EtOAc/CHClj/Acid formic ( 4 : 1 : 1 )
Kết quả cho thấy với các hệ dung môi khác nhau, chất Vj và C3 đều cho
một vết trên bản SKLM.
Chất Vị ở 3 hệ dung môi khai triển đều cho 1 vết với Rf tương ứng là 0,55; 0,64; 0,85 (bảng 3.6 và hình 3.3).
Chất C3 ở 3 hệ dung môi khai triển đều cho 1 vết với Rf tương ứng là 0,46; 0,69; 0,80 (bảng 3.6 và hình 3.4).
Hèi Hsn Hsm
c.ì Cì c.í
Hình 33. Sắc ký đồ của Vị ữong các hệ dung môi I, II, III
Hình 3.4. Sắc ký đồ của C3 trong các hệ dung mồi I, II, III
Âií>4:ỊíV-
. ""ĩ
C3 Tp VI
u v 254nm As thường
Bảng 3.6. Kiểm tra độ tinh khiết của Y ị và C3 bằng SKLM
STT Tinh thể
Rf Màu sắc
H ệ l Hệ II H ê in As thường HƠNH4OH ALCI3/ as thường
1 0,55 0,64 0,85 Vàng xanh Vàng sẫm Vàng sáng
2 c , 0,46 0,64 0,80 Vàng Nâu Vàng sáng 3.6. NHẬN DẠNG CÁC CHẤT PHÂN LẬP Được
3.6.1. Nhận dạng
- Chất Vị dạng tinh thể hình kim mảnh màu vàng nhạt, tan tốt trong methanol, ethanol, khó tan trong chloroform.
- Phổ ư v đo trong MeOH cho đỉnh hấp thụ cực đại ^niax- 255,556 nm và 367,778 nm đặc trưng cho flavonoid có khung flavone.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp phụ mạnh ở
3280,1; 1656,5; 1619,6; 1588,8; 1509,1; 1366,7; 1338,5; 1238,5; 1158,9; 1115,7; 1040,5; 805,6 cm'^
- Phổ khối (MS) cho [M]"^ = 330 mu tưcfng ứng với công thức phân tử: C ^ H iA và các pic mảnh: 315 = 330 - CHgClS); 301 = 315 - 0(16); 259 = 287 - CO(28); 231 mu;. Tra cứu trong thư viện phổ khối chất Vj tương ứng với cấu trúc của 5,6-dimethoxy-7,3,4-trihydroxyflavone.
'5'
CH3O
OCH3O
5,6-dimethoxy-7,3,4-trihydroxyflavone - Phổ cộng hưởng từ 1 chiều (ID - NMR ‘H và NMR
+ Phổ NMR (125MHz, MeOD) cho thấy chất V, có 17 tín hiệu trong đó có 5 carbon bậc 3; không có carbon bậc 2; 2 carbon bậc 1 và 10 carbon bâc 4.
+ Dựa vào phổ NMR *H (500MHz, MeOD) chất Vj có các vị trí proton được xác định như sau:
Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR ‘H của chất Vi
STl' ỗ ppm Độ bội Số proton J(Hz) Vị trí proton
1 7,72 s 1 H3
2 7,70 dd 1 8,5; 2 H .
3 7,09 d 1 8,5 H ,
4 6,72 d 1 2 H2
5 6,36 d 1 2 Hg
Trong đó: 5: độ dịch chuyển hoá học J: Hằng số tương tác
Căn cứ vào phổ u v , IR, MS và NMR chúng tôi nhận dạng chất Vj là 5,6-dimethoxy-7,3,4'-trihydroxyflavone.
3.6.2. Nhận dạng C3
- Thể chất: C3 dạng bột màu vàng, tan tốt trong methanol, ethanol, ethylacetat, ít tan trong nước và chloroform, không tan trong ether.
- Phổ ư v đo trong MeOH cho 255,556 nm và 371,111 nm đặc trưng cho flavonoid có khung flavonol.
- Phổ IR đo trong KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3424,2 cm'*(v-OH), 1610,9 cm-‘(v c=0); 1522,4; 668,7; 480,4 cm'^
- Phổ khối MS cho [M]'*’ = 302 mu, tương ứng với công thức phân tử Ci5Hio0 7. Tra thư viện phổ C3 trùng hợp vói cấu trúc: 3, 3 , 4, 5, 7 penta hydroxy flavon (Quercetine) với độ trùng lặp 95%.
Công thức cấu tạo:
O H % 2 1 3 4 V \ = 6 O H = / 5 ■ O H Quercetine
- Phổ cộng hưởng từ 1 chiều (ID - NMR ‘H và NMR ‘^C)
+ Phổ NMR (125MHz, MeOD) và phổ DEPT 90, DEPT135 cho thấy chất C3 có 15 tín hiệu trong đó có 5 carbon bậc 3, không có carbon bậc 2, không có carbon bậc 1 và 10 carbon bậc 4.
+ Dựa vào phổ NMR (500MHz, MeOD) chất C3 có các vị trí
proton được xác định như sau:
Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của chất C3
S'1'1' ỗ ppm Độ bội Số proton J(H z) Vị trí proton
1 7,75 d 1 2,5 H ,
2 7,65 dd 1 8,5; 2 H .
3 6,90 d 1 8,5 H ,
4 6,40 d 1 2 H6
5 6 ,2 0 d 1 2 Hb
Trong đó: ô: độ dịch chuyển hoá học J: Hằng số tương tác
Căn cứ vào phổ u v , IR , MS và NMR chúng tôi nhận dạng chất C3 là
Quercetine.
3.7. BÀN LUẬN
So với kết quả nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học cây Giảo cổ lam ở Cao Bằng, chúng tôi có một số nhận xét như sau :
Định tính:
- Giống nhau: trong thành phần trên mặt đất đều có flavonoid, saponin, acid amin, acid hữu cơ, sterol.
- Khác nhau: Cây ở Cao Bằng có đường khử, cây ỏ Sapa không có đường
khử.
^ Định lượng;
- Hàm ỉượng cắn trong phân đoạn EtOAc của cây thu hái ở Cao Bằng cao hcfn cây thu hái ở Sapa.
- Ngoài định lượng cắn trong phân đoạn EtOAc và n-BuOH chúng tôi còn định lượng cả cắn trong các phân đoạn n-hexan, và chloroform, trong khi các công trình trước đây chưa quan tàm đến.