2.2.2.1. Đ ịnh tính các nhĩm chất bằng phản ứng hĩa học:
<♦ Đ ịnh tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hoả:
Cân 5 g dược liệu đã được cắt thành miếng nhỏ cho vào bình Soxhlet rồi chiết với ether dầu hoả cho đến khi dung mơi trong bình chiết khơng màu. Lọc dịch chiết qua bơng, cất thu hồi bớt dung mơi, dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính.
Ỷ Định tính chất héo:
Q iấm ba giọt dịch chiết ether dầu hoả trên giấy bĩng mờ, hơ trên bếp điện đến khơ thấy để lại vết mờ trên giấy (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: mẩu nghiên CÍÙI cĩ chất béo.
A Định tính carotenoỉd:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, đun cách thuỷ cho bay hơi hết dung mơi, cắn cịn lại màu nâu, thêm 2 giọt H2SO4 đặc thấy xuất hiện màu xanh lá ở mẫu thử (phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: mẫu nghiên cứu cĩ carotenoid,
^ Định tính phytosteroỉ:
Cho vào ổng nghiệm 1 ml dịch chiết, để bốc hơi dung mơi đến khơ, thêm Im ỉ anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm Im l H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả cho thấy ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vịng tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên cĩ màu xanh (phản ứng dưcmg tính).
❖ Đ ịnh tính các thành phần cĩ trong dịch chiết ethanol:
Bã dược liệu sau khi chiết bằng elher dầu hoả để bay hơi hết dung m ơ i, cho vào bình cầu dung tích 100 ml, thêm 50 ml ethanol 90°, lắp sinh hàn hồi lưu, đun cách thuỷ sơi trong 30 phút, lọc. Dịch lọc để làm các phản ứng định tính.
A Định tínhỷìavonoid: - Phản ứng cyanidin:
Cho ỉ ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm , thêm một ít bột magie kim loại và vài giọt HCl đặc, đun nĩng nhẹ trên nồi cách thuỷ, thấy xuất hiện màu hồng đỏ (phản ứng dương tính).
- Phản ứng với kiềm:
+ Phản ứng với hơi amonỉac: nhỏ 3 giọt địch chiết ethanol lên tờ giấy lọc, hơ nĩng nhẹ cho khơ, trên giấy cĩ vết màu vàng nâu nhạt hơ trên miệng lọ amoniac, thấy màu vàng của vết tăng lên rõ rệt (phản ứng dương tính).
+ Phản ứng với dung dịch N aO H 10%: cho 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm , thêm vài giọt dung dịch N aOH 10% thấy m àu của địch chiết vàng đâm hơn so với dịch chiết ban đầu (phản ứng dưcmg tính).
- Phản ứng với dung dịch F e d Ị 5% ;
Cho 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm , thêm vài giọt dung dịch FeClg 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen (phản ứng dưcíng tính).
Sơ bộ kết luận: mầu nghiên cứu cĩýĩavonoid.
❖ Đ ịnh tính coum arin:
Ỷ Phản ứng m ở - đống vịng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết, ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. ống 2: để nguyên.
Đun cả hai ống nghiêm trên nồi cách thủy đến sơi.Quan sát thấy; Ống 1: cĩ tủa đục trắng.
Ống 2: trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều thấy: Ống 1: trong suốt
Ống 2: cĩ tủa đục.
Acid hĩa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. (Phản ứng dương tính).
^ Soi huỳnh quang:
N hỏ hai giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc, sau đĩ nhỏ tiếp lên 1 giọt NaOH 10%. Để khơ rồi đem soi dưới ánh sáng tử ngoại ở X = 366nm, thấy vết cĩ màu xanh hơi vàng. Sau đĩ làm một mẫu thử khác tương tự: nhỏ hai giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc, thêm m ột giọt N aOH 10%, để khơ. Che nửa vết chất thử bằng m ột mảnh kim loại rồi soi dưới ánh sáng tử ngoại trong khoảng 30 giây, bỏ vật che ra thấy nửa của vết chất thử khơng che cĩ cường độ màu sáng hơn nửa vết chất thử bị che (phản ứng dương tính).
^ Phản ứng diazo hĩa:
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2 ml NaOH 10%. Đun cách thủy đến sơi, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử Diazo, thấy trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch. (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luân: mẫu nghiên cứu cĩ Coumarin
❖ Đ ịn h tín h saponin:
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Q io 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, Ihêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Sau 15 phút thấy cột bọt vẫn cịn (phản ứng dương tính)
^ Các phản ứng tạo màu:
Lấy 5 g bột dược liệu, loại chlorophyl bằng ether ethylic trong bình Shoxlet, sau đĩ chiết với cồn 90° bằng hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc lấy dịch cồn, thêm vào dịch lọc 5 ml dung dịch acid H2SO4 10%, đun cách thuỷ trong 1 giờ, đem lắc với 10 mỉ chloroform. Gạn lấy ỉớp chloroform, bốc hơi dung mơi, cắn được dùng làm các phản ứng định tính sau:
+ Phản ứng Lieberm ann - Burchard: Hồ tan 1/4 lượng cắn trên vào trong 0,5 ml anhydric acetic, thêm 2 giọt acid H2SO4 đặc, đung dịch chuyển sang xanh da trời (phản ứng dưcỉng tính).
+ Phản ứng SaỉkowskÌ\ Hồ tan 1/4 lượng cắn trên vào trong 1 ml
chloroform , thêm 1 ml acid H2SO4 đặc, dung dịch chuyển màu từ vàng nhạt
sang đỏ (phản ứng dưcỉng tính).
+ Phản ứng Rosenthaler. Hồ tan 1/4 lượng cắn trên vào trong 1 ml chloroform, thêm 2 giọt dd vanilin 1% trong ethanol, thêm 1 giọt HCl đặc, dung dịch cĩ màu tím (phản ứng ducfng tính)
Sơ bộ kết luận; m ẫu nghiên cứu cĩ saponin.
*> Đ ịnh tính alcaỉoid:
Lấy 2 gam dược liệu đã tán nhỏ, cho vào bình nĩn dung tích 100 ml, thêm 30 ml dung dịch H2SO4 2%, đun sơi trong 20 phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn dung tích lOOml, kiềm hố dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm (thử bằng chỉ thị màu). Chiết alcaloid dưới dạng
bazơ bằng chloroform (10 ml X 3 lần), sau đĩ chuyển alcaloid sang dạng muối
bằng cách lắc với dung dịch H2SO4 2% . Gạn lấy nước để làm các phản ứng định tính:
- Phản ứng với thuốc thử M ay e n Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, khơng thấy xuất hiện tủa trắng hay vàng nhạt ở mãu thử (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm , thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, khơng thấy cĩ kết tủa nâu ở cả 3 m ẫu thử (Phản ứng âm tính). - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:
Cho 1 mỉ dịch chiết vào ống nghiệm , thêm 2 giọt thuốc thử, khơng thấy kết tủa vàng cam hay đỏ ở mẫu thử (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: mẫu nghiên cứu khơng cĩ aỉcaỉoid.
♦t* Đ ịnh tính glyco sid tim:
Lấy 5 gam dược liệu đã làm nhỏ vào bình nĩn dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 25”, ngâm ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Gạn dịch vào cốc cĩ mỏ, loại tạp bằng lượng Ihừa dung dịch chì acetat 2 0%, lọc loại tủa, loại chì acetat dư bằng dung dịch natri sunfat 30%, để lắng, lọc. Dịch lọc chuyển vào bình gạn và lắc kỹ với chloroform (10 ml - 5 ml - 5 m l ), gạn lấy lổfp chloroform, loại nước bằng N a2SƠ4 khan, lọc. Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung mơi trên nồi cách thuỷ cho đến khơ. c ắ n cịn lại hồ tan trong 4 ml cồn 90° để làm các phản ứng định tính sau:
- Phản ứng Liberman:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn ở trên, thêm 0,5 ml anhydrid acetic. Lắc đều, đặt nghiêng ống nghiêm m ột gĩc 45°, sau đĩ thêm đồng lượng H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm , ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vịng tím đỏ và lớp chất lỏng phía trên cĩ màu xanh khi lắc nhẹ ở m ẫu thử (Phản ứng ducfng tính)
- Phản ứng Baljet:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn ờ trẽn, thêm 0,5 ml thuốc thử Baljet vừa mới pha gồm 9,5 ml acid picric và 0,5 mi dung dịch N aOH 10%, khơng thấy xuất hiện màu da cam ở mẫu thử (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng Legal:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn ở trên, thêm 3 giọt thuốc thử natri nitroprusiat 0,5% và hai giọt dung dịch NaOH 10% khơng thấy xuất hiện màu đỏ ồ mẫu thử (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: các mẫu nghiên cứu khơng cĩ gỉycosid tim.
Định tính antragỉycosid:
- Phản ứng Borntraeger:
Lấy Ig bột dược liệu đã tán nhỏ cho vào ống nghiêm to, thêm dung dịch H2SO4 10% tới ngập dược liệu rồi đun cách thuỷ trong 15 phút. Lọc, để nguội, lắc với ether ethylic trong 2 phút, để yên cho phân lớp, gạn lấy lớp ether ethylic và thêm vào đĩ 8 ml dung dịch NaOH 10%, lớp kiềm khơng cĩ màu đỏ (phản ứng âm tính).
- Phản ứng vi thăng hoa:
Cho khoảng 0,1 g bột dược liệu vào một nút nhơm, đậy bằng một phiến kính, trên đặt m ột miếng bơng cĩ thấm nước, đùng ngọn lửa đèn cồn hơ nhẹ dưới đáy nút nhơm, sau đĩ lấy phiến kính đem soi dưới kính hiển vi, khơng thấy xuất hiện tinh thể gì (phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận: mẫu thử khơng cĩ antragỉycosỉd.
❖ Đ ịnh tính tanỉn:
Cho vào bình nĩn dung tích 100 ml khoảng 2 g được liệu, thêm 20 ml nước cất, đun sơi trên bếp qua lưới amian trong thời gian khoảng 1 0 phút, lọc nĩng, dịch lọc được làm các phản ứng:
- Phản ứng với dung dịch F e d Ị 5%:
Lấy Im l dịch cho vào ống nghiệm thêm vài giọt dung dịch FeCl 5%, thấy xuất hiện màu xanh đen ở mẵu thử (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 2%:
hiện tủa bơng trắng ở mẫu thử (Phản ứng dương tính). - Phản ứng Stiasny:
Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm to thêm 1 ml form ol và 0,5 ml HCl đặc. Đun sơi cách thuỷ trong 10 phút, khơng thấy xuất hiện tủa của tanin pyrocatechic. Sơ bộ kết luận mẫu nghiên cứu cĩ tanin pyrogalic, khơng cĩ tanin pyrocatechic.
❖ Đ ịn h tín h đư ờ ng tự do:
Cho 1 g dược liệu đã làm nhỏ vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất, đun cách thuỷ 3 phút, lọc nĩng lấy dịch lọc. Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B, đun cách thuỷ trong vài phút, thấy xuất hiện tủa đỏ gạch à m ẫu thử. Sơ bộ kết luân trong dịch chiết của cây cĩ đường tự do.
Đ ịn h tính acid hữ u cơ:
Cho 1 g dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml nưởc cất, đun sồi trực tiếp trong 10 phút, để nguội rồi lọc. Thêm vào dịch lọc m ột ít tinh thể Na2C0 3, thấy cĩ bọt khí bay lên (Phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: mẫu nghiên cứu cĩ acid hữu cơ.
❖ Đ ịn h tín h acid am in:
Cho khoảng 2g dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất, đun sơi 5 phút, lọc nĩng. Lấy 2 ml dịch chiết cho vào m ột ống nghiệm khác, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhỵdrin 3%, đun cách thủy sơi 10 phút, dung dịch thấy xuất hiện màu tím (phản ứng dưcfng tính).
Sơ bộ kết luận: mẫu thử cĩ acỉd amin.
STT Nhĩm chất Phản ứng định lính Kết quả Kết luận
1 Glycosid tim Phản ứng Liebennann + Khơng cĩ
Phản ứng Legal - Phản ứng Keller- Kiliani - Phản ứng Baijet - 2 Flavonoid Phản ứng Cyanidin ++ Cĩ Phản ứng với NaOH ++ Phản ứng với NH3 ++ Phản ứng với FeCl35% ++
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt + Cĩ Các phản ứng tạo màu +
4 Coumarin Phản ứng mở- đĩng vịng lacton ++ Cĩ Phản ứng chuyển dạng đồng phân
cis- trans. +
Phản ứng với thuốc thử Diazo +
5 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Khơng cĩ
Vi thăng hoa -
6 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2SƠ3 + Cĩ 7 Tanin Phản ứng với FeClj 5% ++ Cĩ
Phản ứng với Gelatin 2% +
8 Đường khử Phản ứng với r r Fehling A và + Cĩ Fehling B
9 Alcaloid Phản ứng với các '1’1' Khơng cĩ
Mayer -
- Dragendoff -
- Bouchardat -
1 0 Acid amin Phản ứng với 'i rNinhydrin 3% + Cĩ
11 Chất béo Thử trên giấy + Cĩ
12 Carotenoid Phản ứng v ớ i d d H 2 S O 4 đ ặ c + Cĩ 13 Phytosterol Phản ứng Liebermann + Cĩ
Ghi chú: -): phản ứng ấm tính. (+): Phẩn ứng dương tính (++): Phản ứng rõ. K ết luận: Trong lá cây Nhội cĩ Flavonoid, Coumarin, đường khử, caroten, Tanin, chất béo, phytosterol, acid amin, saponin; khơng cĩ glycosiđ tim, antharanoid, alcaloid.
2.2.2.2. X ác định độ ấm của dược liệu:
Lấy khoảng 2 g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm Sartorius, điều chỉnh nhiệt độ 105°c. Đổ dược liệu lên đĩa cân và trải đều, đậy nắp cân và đợi m áy tự động hiện kết quả lên màn hình, sau 5 phút đọc kết quả. Độ ẩm của được liệu là 12,54% .
2 2 .2 3 . Định lượng F lavonoid tồn phần:
Cân chính xác khoảng 18g được liệu, cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng Chloroform đến khi trong bình khơng cồn màu xanh. Dịch chiết Chloroform gộp lại, cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm, tiếp tục bay hơi trên nồi cách thủy đến khồ thu được cắn A. Lấy túi
dược liệu ra khỏi bình Soxhlet, để bay hết hơi Chloroform tới khơ rồi đặt lại
vào bình, chiết tiếp bằng MeOH đến khi dịch chiết trong bình trong suốt (thử khơng cho màu vàng với NaOH IN). Tập trung dịch chiết M eOH, đem cất thu hồi dưới áp suất giảm , tiếp tục bay hơi trên nổi cách thủy đến khơ thu được cắn B. Hịa tan cắn B vào nước nĩng, đun cách thủy 20 phút, lọc nĩng lần lượt qua m ột phễu cĩ lĩt bơng sau đĩ lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lọc và tráng nhiều lần như vậy để loại tạp. Để nguội, gộp dịch lọc vào bình gạn, lắc với ethylacetat nhiều lần cho tới khi phần ethyl acetat trong suốt khơng màu. Gộp dịch chiết ethyl acetat, cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm, sau đĩ bay hơi trên nồi cách thủy đến khơ thu được cắn c . Sấy cắn c ở 70"c đến khối lượng khơng đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút rồi đem cân ngay. Kết quả xác định hàm lượng flavonoid được trình bày ở bảng 2.2.
Hàm lượng cắn c được tính theo cơng thức:
x % - ---^---rxioo
M X ( l - a )
trong đĩ: X là hàm lượng % cắn c m là khối lượng cắn (g).
M là khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g) a là độ ẩm của dược liệu (%).
rr Khối lượng dược liệu(g) Độ ẩm a (%) Khối lượng cắn (g) Hàm lượng cắn c (%) 18,0510 12,54 0,825 5,26 18,1015 12,54 0,823 5,22 18,0671 12,54 0,837 5,23 18,0528 12,54 0,839 5,31 18,0554 12,54 0,83 5,26 TB 5,26 ± 0,04 Hàm lượng cắn trung bình là 5,26 ± 0,04%. 2.2.2A . Đ ịnh tính fla vo n o id hằng SKLM:
- Dịch chấm sắc ký: cắn c được chiết xuất theo qui trình mơ tả mục 2.2.2.3- Hịa tan cắn c trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254(Merck) tráng sẵn, được hoạt hĩa ở 110°c trong Ih. - Hệ dung mơi khai triển: Để chọn hệ dung mơi cĩ khả nãng tách tốt các thành phần trong Flavonoid tồn phần, 8 hệ đã được thăm dị:
Hệ I: Chloroform: M ethanol (9:1)
Hệ II: Toluen: chloroform: aceton (8:5:7)
Hệ III: Ethyl acetat: chloroform; Acid form ic(3:3:l)
Hệ IV; Toluen: Ethyl acetat: Aceton: Acid formic (5:2:2:1) Hộ V: Toluen: Ethyl acetat: Acid Form ic(5: 6:1)
Hệ VI: Toluen: Ethyl acetat: Acid Form ic(5:6:l,5) Hệ VII: Toluen: Ethyl acetat: Acid Form ic (5:4; 1) Hệ VIII: Toiuen: Acid Fomic: HjO (8:1:1) - Hiện màu: bằng hơi amoniac và soi dưới đèn tử ngoại.
Kết quả, hệ V, VII cho kết quả tách tốt nhất. Phát hiện vết dưới ánh sáng thường, soi dưới đèn tử ngoại. Sau đĩ hơ trên miệng lọ amoniac rồi quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sĩng 366nm. Kết quả định tính Flavonoid tồn phần
bằng SKLM được trình bày ở bảng 2.3, hình 2.6a (với hệ dung mơi VII) và bẳng 2.4, hình 2.6b (với hệ dung mơi V).
Bảng 2 3 - V ị trí và màu sắc các vết cố trong cắn c với hệ dung mơi V ĩỉ
'1'1’ R, xioo Màu sắc vết Ánh sáng thường u v 1 6,5 Nâu nhạt Xanh sáng 2 12,91 Vàng Nâu 3 22,56 Xanh sáng 4 35,47 Vàng Xanh sáng 5 41,97 Nâu đậm Nâu đậm 6 45,22 Vàng đậm Xanh sáng 7 51,63 Vàng nhạt Nâu 8 58,13 Vàng nhạt Hổng 9 61,28 Xanh sáng 1 0 64,53 Nâu đậm 11 67,78 Hồng đậm 1 2 77,44 Hồng 13 83,94 Xanh sáng 14 90,35 Hồng 15 93,98 Xanh sáng
Bảng 2.4 - Vị trí và màu sắc các vết cĩ trong cắn c với hệ dung mơi V