2.2.3.1. Xđy dựng phương phâp V
Tiến hănh quĩt phổ của artesunat sử dụng ethanol 90° vă NaOH 0,1 N để pha vă thuỷ phđn artesunat chuẩn.
Câch lăm: Cđn 25 mg artesunat chuẩn cho văo bình định mức 50 ml. Hoă tan trong ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50 ml. Bổ sung NaOH 0,1 N văo cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Thuỷ phđn dung dịch trín ở nhiệt độ 50° ± l°c
trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh. Tiến hănh quĩt phổ của dung dịch trín trong khoảng bước sóng từ 400 nm đến 190 nm. Kết quả thu được cho thấy artesunat sau khi pha bằng ethanol 90° vă thuỷ phđn 60 phút trong NaOH 0,1 N có cực đại hấp thụ ở bước sóng 289 nm.
2.2.3.2. Khảo sât khoảng tuyến tính của phương phâp
Tiến hănh pha 6 dung dịch artesunat chuẩn trong ethanol 90°, rồi pha loêng câc dung dịch năy trong NaOH 0,1 N để được câc dung dịch có nồng độ khâc nhau lần lượt lă: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 mg/ml. Thuỷ phđn câc dung dịch trín trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50 ± 1° c trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh, tiến hănh đo độ hấp thụ của câc dung dịch trín trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dăy 1 cm. Mẫu trắng lă NaOH 0,1 N được xử lý trong cùng điều kiện với câc dung dịch trín.
2.2.3.3. Khảo sât độ lặp lại của phương phâp
Dung dịch chuẩn: Cđn chính xâc một lượng artesunat chuẩn khoảng 130 mg cho văo bình định mức 100 ml. Thím văo bình 70 ml ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50 ml, thím dung dịch NaOH 0,1 N cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều.
Dung dịch thử: Cđn 20 viín artesunat, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn chính xâc một lượng bột viín tương đương 130 mg artesunat cho văo bình định mức lOOml. Thím văo bình 70 ml ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50 ml, thím dung dịch NaOH 0,1 N cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều.
Câch tiến hănh: Thuỷ phđn câc dung dịch trín ở nhiệt độ 50 ± l°c trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh, tiến hănh đo độ hấp thụ câc dung dịch trín trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm. Mẫu trắng lă NaOH 0,1 N cũng được xử lý trong cùng điều kiện với câc dung dịch trín.
Nồng độ artesunat có trong 1 viín được tính theo công thức:
c% = Dt Mc — xH D c . Mt .m Trong đó Dt Dc m; m Mt Mc H Độ hấp thụ của dung dịch thử. Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. Khối lượng trung bình viín (mg). Hăm lượng của viín (mg/v). Khối lượng bột đê cđn (mg).
Khối lượng artesunat chuẩn đê cđn (mg). Hăm lượng artesunat chuẩn. v
Thực hiín 5 lần định lượng, kết quả được ghi trong bảng 2.10.
2.2.3.4. Khảo sât tính đúng của phương phâp
Để xâc định tính đúng của phương phâp chúng tôi tỉến hănh định lượng bằng phương phâp thím chuẩn. Câch thức tiến hănh được thực hiện như sau:
Dung dịch thử: Cđn 20 viín, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn một lượng bột viín tương đương khoảng 100 mg artesunat, cho văo bình định mức 100 ml. Thím 70 ml ethanol 90° văo bình định mức, siíu đm cho tan hết, bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh dung dịch trín qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho lần lượt văo câc bình định mức 50 ml được đânh số lần lượt từ 0 đến 6.
Cđn chính xâc 2,5 mg artesunat chuẩn cho văo lần lượt câc bình định mức được đânh số từ 1 đến 6, thím dung dịch NaOH 0,1 N cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều.
Tiến hănh thuỷ phđn câc dung dịch trín ở nhiệt độ 50 ± 1° c trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh. Đo độ hấp thụ của câc dung dịch trín trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± lnm trong cốc đo dăy 1 cm. Mẫu trắng lă dung dịch NaOH 0,1 N được xử lý trong cùng điều kiện.
Kết quả được ghi ở bảng 2.11.
2.2.3.5. Định lượng một s ố mẫu viín nĩn artesunat do câc xí nghiệp trong nước sản xuất
Pha mẫu dung dịch thử vă dung dịch chuẩn như trong mục 2.2.3.3.
Tiến hănh thuỷ phđn câc dung dịch trín ở nhiệt độ 50 ± l°c trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh. Đo độ hấp thụ của câc dung dịch trín trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dăy 1 cm. Mẫu trắng lă NaOH 0,1 N được xử lý trong cùng điều kiện.
Thực hiện 5 lần định lượng đối với mỗi mẫu thử, kết quả được ghi trong bảng tương ứng (từ bảng 2.12 đến bảng 2.15).
2.2.3.6. Kết quả
• Khảo sât khoảng tuyến tính của phương phâp:
Bảng 2.9: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ văo nồng.độ dung dịch. Nồng độ artesunat
(mg/ml)
0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8
Độ hấp thụ (D) 0,1776 0,3356 0,6675 1,2329 2,4660 4,9327
Nồng độ (mg/ml)
Hình 2.3 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ văo nồng độ. Từ đồ thị trín ta thấy:
- Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa độ hấp thụ của dung dịch vă nồng độ dung dịch: y = 6,121 lx + 0,0286
- Hệ số tương quan: R2 = 0,9999.
Kết luận: v
- Hệ số tương quan của đường hồi quy gần bằng 1.
- Tất cả câc giâ trị đo đều nằm trín đường hồi quy hoặc phđn bố đồng đều về hai phía của đường hồi quy.
Vậy: Phĩp đo lă tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,025 đến 0,8 mg/ml.
• Khảo sât độ lặp lại của phương phâp:
Bảng 2.10. Khảo sât độ lặp lại của phương phâp.
STT Lượng bột cđn Mt (mg) Độ hấp thụ (Di) Hăm lượng % viín (C%) Hăm lượrỉg viín Xi(mg/v) Câc số liệu thống kí 1 702,6 0,6634 100,79 50,39 X = 49,98 c % = 99,96 ô = 0,37 RSD%= 0,74 x=49,98 ± 0,46 2 702,4 0,6588 100,12 50,06 3 701,6 0,6512 99,08 49,54 4 702,6 0,6614 100,49 50,12 5 701,9 0,6529 99,31 49,65 Mc= 130,4 (mg); Dc = 0,6540; Mv = 270 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); t(0>9 5;4) = 2,78; 8 = 0,46. Từ kết quả bảng 2.10 ta có: - Giâ trị trung bình: X = 49,98. - Độ lệch chuẩn: 6 = 0,37.
- Khoảng tin cậy của giâ trị trung bình: 8 = 0,46.
=> X = 49,98 ± 0,46.
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = 0,74 < 2%.
Vậy phương phâp có độ lặp lại cao với mức tin cậy p = 0,95. • Khảo sât tính đúng của phương phâp:
Bảng 2.11. Khảo sât tính đúng của phương phâp. ST T Lượng artesunat có sẵn (mg) Lượng artesunat thím văo (mg) Độ hấp thụ (Di) Lượng artesunat tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi X(%) 1 0,1 0,051 0,7832 0,0503 V 98,62 2 0,1 0,052 0,7953 0,0523 100,57 3 0,1 0,051 0,7918 0,0520 101,96 4 0,1 0,053 0,7931 0,0522 98,49 5 0,1 0,054 0,8036 0,0543 100,56 Dc = 0,5209; x% =100,04; ô = 1,47; RSD% = 1,47 t(0,9 5;4) = 2,78; 8 = 1,83; x% = 100,04 ± 1,83%.
Qua kết quả ở bảng 2.11 trín cho thấy: - Giâ trị trung bình: X = 100,04%. - Độ lệch chuẩn: ỗ =1,47.
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = 1,47.
Sự khâc nhau giữa lượng thím văo vă lượng tìm lại lă không có ý nghĩa thống kí với mức tin cậy p = 0,95.
Vậy phương phâp cho kết quả đúng.
Kết luận: Với tính đúng, tính chính xâc cao vă với sự tuyến tính chặt chẽ giữa độ hấp thụ của dung dịch với nồng độ artesunat trong khoảng đê khảo sât cho thấy phương phâp năy có thể âp dụng để định lượng viín nĩn artesunat.
• Kết quả định lượng một số mẫu viín nĩn artesunat do câc cơ sở trong nước sản xuất.
* Mẫu của công tỵ c ổ phần dược phẩm Traphaco:
Bảng 2.12: Kết quả định lượng mẫu của công ty Traphaco. STT Lượng bột cđn Mt (mg) Độ hấp thụ (Di) Hăm lượng % viín (C%) Hăm lượng viín Xi(mg/v) Câc số liệu thống kí 1 696,5 0,6731 99,02 49,51 X = 49,78 c % = 99,56 ô = 0,46 RSD% - 0,92 x=49,78 ± 0,57 2 696,4 0,6719 98,86 49,43 s, 3 696,5 0,6747 99,25 49,63 4 696,8 0,6878 101,14 50,57 5 696,7 0,6768 99,53 49,78 Mc= 130,2 (mg); Dc = 0,6753; Mv = 268 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); t(0,9 5;4) = 2,78; 8 = 0,57.
* Mầu của xí nghiệp dược phẩm 120 (Apharma):
Bảng 2.13: Kết quả định lượng mẫu của xí nghiệp 120.
STT Lượng bột cđn Mt (mg) Độ hấp thụ (Dị) Hăm lượng % viín (C%) Hăm lượng viín Xi(mg/v) Câc số liệu thống kí 1 785,2 0,6884 99,71 49,86 X = 50,02 c % = 100,04 s = 0,52 RSD% = 1,04 x=50,02 ± 0,65 2 785,5 0,6936 100,43 50,22 3 785,0 0,6813 98,72 49,36 4 785,3 0,6892 99,82 49,91 5 785,6 0,7013 101,54 50,77 Mc= 130,5 (mg); Dc = 0,6871; Mv = 302 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); t(0;95;4) = 2,78; 8 = 0,65'.
* Mẫu của công ty c ổ phần hoâ dược phẩm M ekophar:
Bảng 2.14: Kết quả định lượng mẫu của công ty Mekopha. STT Lượng bột cđn Mị (mg) Độ hấp thụ (Di) Hăm lượng % viín (C%) Hăm lượng viín x,(mg/v) Câc số liệu thống kí 1 871,1 0,6729 98,90 49,45 X = 49,69 c % = 99,37 s = 0,30 RSD% = 0,60 x=49,69 ± 0,37 2 871,4 0,6782 99,65 49,83 3 871,6 0,6823 100,23 50,12 4 871,2 0,6759 99,33 49,67 5 870,9 0,6715 98,72 49,36 Mc= 130,0 (mg); Dc = 0,6745; Mv = 335 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); t(0>95;4) = 2,78; e = 0,37.
* Mẫu của công ty Dược khoa:
Bảng 2.15: Kết quả định lượng mẫu của cổng ty Dược khoa.
STT Lượng bột cđn Mt (mg) Độ hấp thụ (Dị) Hăm lượng % viín (C%) Hăm lượng viín Xj (mg/v) Câc số liệu thống kí 1 702,5 0,6940 99,28 50,09 X = 50,04 c % = 99,60 6 = 0,20 RSD% - 0,39 x=50,04 ± 0,25 2 702,4 0,6939 99,27 50,09 3 702,5 0,6885 98,78 49,69 4 702,7 0,6858 100,41 50,21 5 702,6 0,6948 100,28 50,14 Mc= 130,2 (mg); Dc = 0,6874; Mv = 270 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); t(0,9 5;4) = 2,78; 8 = 0,25, 37
Kết luận: Theo quy định của Dược điển quốc tế (2003), hăm lượng artesunat phải đạt được nồng độ nằm trong khoảng 90% - 110% so với hăm lượng ghi trín nhên.
Căn cứ văo kết quả định lượng trín, có thể kết luận câc mẫu thuốc do câc xí nghiệp trín sản xuất đều đạt tiíu chuẩn theo quy định của Dược điển vă được sử dụng để điều trị sốt rĩt.
2.2.4. So sânh kết quả định lượng câc mẫu thuốc artesunat trín bằng hai phương phâp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao vă đo quang phổ tử ngoại vùng
khả kiến
2.2.4.1.Nguyín tắc so sânh [9] • So sânh độ chính xâc:
Dùng tiíu chuẩn F (So sânh F ’ với F0):
F’ = |4 (8[> s2)
2
Trong đó : : Độ lệch chuẩn của phương phâp 1. v
§ 2 : Độ lệch chuẩn của phương phâp 2. Tra bảng tìm F0 với a = 0,05;
Nếu F < F0, sự sai khâc về độ chính xâc lă không có ý nghĩa thống kí. Nếu F > F0, thì hai phương phâp có độ chính xâc khâc nhau có ý nghĩa.
• So sânh hai giâ trị trung bình:
So sânh hiệu X ^-X ^ với e v s2 được tính theo công thức:
e i = ta, n-Ss.
Trong đó: x ì : Giâ trị trung bình của phương phâp 1. X2 : Giâ trị trung bình của phương phâp 2.
tan : tra bảng với a = 0,0 1; n = Ĩ11 + n2 - 1.
X
n„ + n2-2 1
' 1 ---1----1 ' vni n2>
Nếu Xj - x 2 < Si thì có nghĩa lă X, vă X2 phù hợp với nhau nghĩa lă cùng đại diện cho một giâ trị thực. v
Nếu X, - X 2 > Si thì có nghĩa lă X, vă X2 không phù hợp (có thể một trong hai giâ trị hoặc cả hai có sai số).
2.2.4.2.S0 sânh độ chính xâc vă hai giâ trị trung bình của hai phương phâp đối với câc mẫu cụ thể
• Mẫu của Traphaco:
Si = 0,53; ỗ2= 0,46; x > 49,45; x ; = 49,78; sỗ = 0,16;
a = 0,05; n1 = n2 = 5; F0 = 6,39; t(095;9) = 2,26; = 0,36; Ta có:
F = 1,33
= 0,33
Kết luận: F ’ < F0 tức lă hai phương phâp có độ chính xâc như nhau với độ tin cậy p = 0,95.
< nghĩa lă giâ trị trung bình của hai phương phâp khâc nhau không có ý nghĩa thống kí ở mức tin cậy p = 0,95.
• Mẫu của Mekopha:
ồl = 0,42; s2 = 0,30; = 49,74; x¡ = 49,69; s5 = 0,23; a = 0,05; n1 = n2 = 5; F0 = 6,39; t(095.9) = 2,26; ồ! = 0,52; Ta có: F = 1,96 X^-XT = 0 ,0 5 x , - x 2 39
Kết luận: F ’ < F0 tức lă hai phương phâp có độ chính xâc như nhau với độ tin cậy p = 0,95.
X, - X 2 < 0! nghĩa lă giâ trị trung bình của hai phương phâp khâc nhau không có ý nghĩa thống kí ở mức tin cậy p = 0,95.
• Mẫu của xí nghiệp 120:
Ô! = 0,69; ỗ2 = 0,52; x ; = 49,73; x¡ = 50,02; s6 = 0,39;
a = 0,05; Ü! = n2 = 5; F0 = 6,39; t(095;9) = 2,26; Sj = 0,88; Ta có:
F ’ = 1,76
X¡"-X¡| = 0 ,2 9
Kết luận: F ’ < F0 tức lă hai phương phâp có độ chính xâc như nhau với độ
V.
tin cậy p = 0,95.
X, - X , < S1 nghĩa lă giâ trị trung bình của hai phương phâp khâc
nhau không có ý nghĩa thống kí ở mức tin cậy p = 0,95. • Mẫu của công ty Dược khoa:
ôi = 0,30; ô2 = 0,20; x ; = 49,99; x ; = 50,04; Sô = 0,16;
a =0,05; n1 = n2 = 5; F0 = 6,39; t(095.9) = 2,26; Si = 0,36;
Ta có:
F ’ = 2,25
x , - x 2 = 0,05
Kết luận: F ’ <F0 tức lă hai phương phâp có độ chính xâc như nhau với độ tin cậy p = 0,95.
x ^ -x 7 < 8; nghĩa lă giâ trị trung bình của hai phương phâp khâc nhau không có ý nghĩa thống kí ở mức tin cậy p = 0,95.
2.3. Đề nghị phương phâp định lượng
Qua câc kết quả định lượng trín chúng tôi thấy thuốc viín nĩn Artesunat có thể được định lượng bằng một trong hai phương phâp sau:
2.3.1. Phương phâp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detecter u v
- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch Artesunat chuẩn trong acetonitril để thu được dung dịch có nồng độ chính xâc khoảng 4 mg/ml.
- Dung dịch thử: Cđn 20 viín, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn một lượng bột viín tương ứng khoảng 100 mg Artesunat cho văo bình định mức. Hoă tan bằng acetone R, siíu đm 10 phút. Lọc nhanh qua giấy lọc. Bốc hơi dịch lọc đến khô. Hoă tan cắn trong acetonitril, siíu đm cho tan hết, chuyển dung dịch văo bình định mức 25 ml. Thím acetonitril vừa
đủ đến vạch vă lắc đều.
Dung dịch chuẩn vă dung dịch thử được lọc qua măng lọc milipore 0,45 Ịim trước khi bơm văo mây. Tiến hănh chạy sắc ký theo câc điều kiện:
- Cột sắc ký: LC 18 v
- Pha động: acetonitril/đệm phosphat pH 3,0 (đê được lọc) = 50/50. - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Bước sóng phât hiện: 216 nm. - Lượng mẫu tiím văo cột: 5 jLil.
- Nhiệt độ cột: 27°c.
Hăm lượng artesunat trong mẫu thử được tính dựa văo việc so sânh diện tích píc với mẫu chuẩn trong khoảng tuyến tính.
2.3.2. Phương phâp đo quang phổ vùng tử ngoại
Nhđn xĩt:
Do artesunat tan tốt trong ethanol tuyệt đối cũng như trong ethanol 90° vă cực đại hấp thụ của artesunat trong ethanol 90° cũng trùng với cực đại hấp thụ của artesunat trong ethanol tuyệt đối nín chúng tôi đề nghị dùng ethanol 90° thay thế cho ethanol tuyệt đối để tiết kiệm chi phí.
Tiến hănh: Cđn 20 viín, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn chính xâc một lượng bột viín tương đương 130 mg artesunat cho văo bình định mức 100 ml, thím 70 ml ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Hút chính xâc 5 ml dung dịch năy