- Âp dụng phương phâp ghi trong Dược điển quốc tế (2003) vă Dược điển Việt Nam m (2002) để lăm cơ sở xđy dựng phương phâp định lượng.
2.2.1. Xử lý kết quả phản tích
Mỗi phĩp thử được lặp lại n lần trong cùng một điều kiện để cho câc kết quả tương ứng x l5 x2, x3, xn. Câc số liệu năy được xử lý thống kí để xâc định gia trị trung bình X , độ lệch chuẩn ô, sai số tương đối s . ..
- Y x :
Giâ trị trung bình X = [9]
n
Độ lích chuẩn ô = J---- — [9]
n-1
Độ lệch chuẩn tương đối RSD% = J t xioo [9]
X
Khoảng tin cậy 8 = - ĩ'í)~ [9]
V n
Cận tin cậy JLL = X ± t(p;2- [9]
Vn
Trong đó: X : Giâ trị trung bình. X; : Giâ trị thực.
5 : Độ lệch chuẩn.
RSD% : Độ lệch chuẩn tương đối. 8 : Khoảng tin cậy.
: Cận tin cậy.
2.2.2. Phương phâp sắc ký lỏng hiệu năng cao
2.2.2.1. Xđy dựng phương phâp '•
Artesunat lă một chất có khả năng tan tốt trong câc dung môi phđn cực, đặc biệt lă tan tốt trong acetonitril [23].
Mặt khâc, thay đổi tỷ lệ dung môi pha động lă hỗn hợp acetonitril : đệm pH 3,0 (đê được lọc) để tiến hănh chạy sắc ký mẫu artesunat được pha trong acetonitril với điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: LC18 Supelcosil 7,5 cm X 2,1 mm, 3 |um. - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Bước sóng phât hiện: 216 nm. - Thể tích tiím: 5 Ịil.
- Pha động: acetonitril/dung dịch đệm phosphat pH 3,0 = 50/50.
-Nhiệtđộ cột: 27°c.
Qua kết quả sắc ký, chúng tôi nhận thấy với tỷ lệ dung môi pha động lă hỗn hợp acetonitril : đệm phosphat pH 3,0 = 50 : 50 thu được píc artesunat gọn, rõ răng, có thời gian lưu nhỏ (tR = 6,334 phút) như hình 2.1.
Hình 2.1. Sắc đồ của artesunat
Vì vậy chúng tôi đê chọn acetonitril lăm dung môi dùng để pha mẫu artesunat vă dùng hệ dung môi acetonitril : đệm phosphat pH 3,0 với tỷ lệ 50 : 50 để tiến hănh chạy sắc ký định lượng câc mẫu thuốc artesunat.
2.2.2.2. Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: LC18 Supelcosil 7,5 cm X 2,1 mm, 3 |um. - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Bước sóng phât hiện: 216 nm. - Thể tích tiím: 5 Ịil.
- Pha động: acetonitril/dung dịch đệm phosphat pH 3,0 = 50/50. - Nhiệt độ cột: 27 °c.
2.2.2.3. Định lượng mẫu chuẩn thứ cấp
Dung dịch chuẩn: Cho toăn bộ lượng artesunat có trong ống chuẩn (150 mg) văo bình định mức 25 ml. Hoă tan bằng acetonitril, siíu đm cho tan hết. Bổ sung dung môi acetonitril cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều.
Dung dịch thử: Cđn chính xâc khoảng 150 mg artesunat cho văo bình định mức 25 ml. Hoă tan bằng acetonitril, siíu đm cho tan hết. Bổ sung dung môi đến vạch vă lắc đều.
Lọc dung dịch chuẩn vă dung dịch thử trín qua măng lọc milipore 0,45 |um. Tiến hănh chạy sắc ký dung dịch chuẩn vă dung dịch thử trín ở điều kiện đê níu trong mục 2.22.2.
Hăm lượng artesunat trong mẫu định lượng được tính theo công thức:
c % = V £ c. xH
Sc-m;
Trong đó : St : Diện tích píc của mẫu chuẩn. Sc : Diện tích píc của mẫu thử. mc : Khối lượng của mẫu chuẩn (mg). mị : Khối lượng của mẫu thử (mg). Kết quả thu được được ghi trong bảng 2.1.
2.2.2.4. Khảo sât khoảng tuyến tính của phương phâp '
Tiến hănh khảo sât sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích píc theo nồng độ bằng câch pha câc dung dịch artesunat chuẩn trong pha động có nồng độ lần lượt lă 0,5; 1; 2; 4; 8 mg/ml.
Tiến hănh chạy sắc ký với điều kiện đê níu ở mục 2.2.2.2. Kết quả được ghi trong bảng 2.2.
2.2.2.5. Khảo sât độ lặp lại
- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch artesunat chuẩn trong acetonitril để thu được dung dịch có nồng độ chính xâc khoảng 4 mg/ml.
- Dung dịch thử: Cđn 20 viín, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn một lượng bột viín tương ứng khoảng 100 mg artesunat cho văo bình định mức. Hoă tan bằng acetone R, siíu đm 10 phút. Lọc nhanh qua giấy lọc. Bốc hơi dịch lọc đến khô. Hoă tan cắn trong acetonitril, siíu đm cho tan hết, chuyển dung dịch văo bình định mức 25 ml. Thím acetonitril vừa đủ 25 ml vă lắc đều Lọc qua măng lọc milipore 0,45 |Lim.
- Tiến hănh: Chạy sắc ký câc dung dịch thử vă dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký đê được níu trong mục 2.2.2.2.
Lượng artesunat (X) trong một viín được tính theo công thức: x = St-Cc -Mv xH
Sc.Mi .25
Trong đó : s, : diện tích píc của dung dịch thử. Sc : diện tích píc của dung dịch chuẩn.
Cc : nồng độ của dung dịch artesunat chuẩn (mg/ml). Mị : khối lượng bột viín đê cđn (mg).
Mv : khối lượng trung bình viín (mg). H : Hăm lượng % của artesunat chuẩn.
Thực hiện 5 lần định lượng, kết quả được ghi trong bảng 2.3.
2.2.2.6. Khảo sât độ đúng
Để kiểm tra độ đúng của phương phâp chúng tôi tiến hănh định lượng bằng phương phâp thím chuẩn.
Dung dịch thử: Cđn 20 viín, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn một lượng bột viín tương ứng khoảng 25 mg artesunat cho văo bình định mức. Hoă tan trong aceton R, siíu đm 10 phút, lọc nhanh dung dịch qua giấy lọc. Chuyển dịch lọc văo bình cầu cất quay. Bốc hơi dịch lọc đến khô. Hoă tan cắn trong acetonitril, siíu đm cho tan hết. Chuyển dung dịch văo bình định mức 25 ml. Thím văo dung dịch đó một lượng chính xâc artesunat chuẩn (khoảng 0,25 mg), siíu đm cho tan hoăn toăn. Thím acetonitril vừa đủ đến vạch v ă lắc đều. Lọc dung dịch qua măng lọc milipore 0,45 |Lim.
Dung dịch chuẩn: Tiến hănh pha dung dịch chuẩn như pha dung dịch thử nhưng không cho thím artesunat chuẩn.
Tiến hănh chạy sắc ký câc dung dịch thử vă dung dịch chuẩn đê pha ở trín trong cùng điều kiện sắc ký đê níu ở mục 2.2.2.2.
Thực hiện 5 lần định lượng, kết quả được ghi ở bảng 2.4.
2.2.2.7. Định lượng một s ố mẫu viín nĩn artesunat do cấc cơ sở trong nước sản xuất
Pha dung dịch chuẩn vă dung dịch thử như trong mục 2.2.2.5.
Tiến hănh chạy sắc ký câc dung dịch trín trong cùng điều kiện đê níu ở mục 2.2.2.2.
Thực hiện 5 lần định lượng đối với mỗi mẫu thử, kết quả định lượng được ghi trong câc bảng (từ bảng 2.5 đến bảng 2.8).
2.2.2.8.Kết quả
Bảng 2.1. Kết quả định lượng artesunat chuẩn thứ cấp. STT Khối lượng bột đê cđn rrii(mg) Diện tich píc Si Hăm lượng artesunat c% 1 150,1 1361684 99,20 2 150,2 1361081 99,09 3 150,4 1364268 99,19 4 150,3 1363087 99,17 5 150,2 1361493 99,12 mc 150,0 1352547 c %= 99,15%
Với kết quả định lượng c % = 99,15%, chúng tôi đê chọn artesunat do trường Đại học Dược sản xuất lăm chất chuẩn thứ cấp để định lượng câc mẫu chế phẩm.
• Khảo sât khoảng tuyến tính:
Bảng 2.2: Sự phụ thuộc của diện tích píc văo nồng độ dung dịch. Nồng độ Artesunat
(mg/ml)
0,5 1 2 4 8
Diện tích Píc 269720 517609 1022822 2034690 4020458
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc văo nồng độ.
- Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa diện tích píc vă nồng độ dung dịch: y = 500487x + 21551
- Hệ số tương quan: R2 = 1. Kết luận:
- Hệ số tương quan của đường hồi quy bằng 1. - Tất cả câc giâ trị đo đều nằm trín đường hồi quy.
Vậy: Phĩp đo lă tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,5 đến 8 mg/ml. • Khảo sât độ lặp lại:
Bảng 2.3: Khảo sât độ lặp lại của phương phâp định lượng bằng HPLC.
STT Lượng bột cđn Mi (mg) Diện tích píc Si Hăm lượng % viín (C%) Hăm lượng viín X;(mg/v) Câc số liệu thống kí 1 669,7 2259124 100,22 50,11 X = 49,62 c % = 99,23 8 = 0,49 RSD% = 0,99 x=49,62 ± 0,61 2 670,0 2215649 98,22 49,11 3 671,3 2265642 100,26 50,13 4 670,5 2236873 99,10 49,55 5 670,2 2218845 98,36 49,18 Cc= 4,02 (mg/ml); Sc = 2247678; Mv = 335 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); t(0;95.4) = 2,78; 8 = 0,61. Từ kết quả bảng 2.3 ta có: Giâ trị trung bình: X = 49,62. Độ lệch chuẩn: s = 0,49.
Khoảng tin cậy của giâ trị trung bình: 8 = 0,61.
=> x = 49,62 ±0,61.
• Khảo sât độ đúng của phương phâp:
Bảng 2.4 : Khảo sât độ đúng của phương phâp định lượng artesunat.
Lượng artesunat có sẵn (mg) Lượng artesunat chuẩn thím văo (mg) Diện tích pícSi Lượng artesunat tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi X(%) 1 1,0004 0,2514 726330 0,2517 100,10 2 1,0004 0,2515 726540 0,2521 100,20 3 1,0004 0,2511 724945 0,2493 99,30 4 1,0004 0,2520 725378 0,2500 99,20 5 1,0004 0,2518 726112 0,2513 99,80 Cc = 1,0004 (mg/ml); Sc = 579853; X % = 99,72; 6 = 0,45; RSD% = 0,45; t(0,95;4) = 2,78; 8 = 0,56; x% = 99,72 ±0,56%.
Qua kết quả ở bảng 2.4 trín cho thấy: - Giâ trị trung bình: X %= 99,72%. - Độ lệch chuẩn: s = 0,45.
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = 0,45.
Sự khâc nhau giữa lượng thím văo vă lượng tìm lại lă không có ý nghĩa thống kí với mức tin cậy p = 0,95.
Vậy phương phâp cho kết quả đúng.
Kết luận: Với tính đúng, tính chính xâc cao vă với sự tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc thu được với nồng độ artesunat trong khoảng đê khảo sât cho thấy phương phâp năy có thể âp dụng để định lượng viín nĩn artesunat.
• Kết quả định lượng một số mẫu viín nĩn artesunat do câc cơ sở trong nước sản xuất.
* Viín nĩn artesunat do công ty Traphaco sản xuất:
Bảng 2.5: Kết quả định lượng mẫu của công ty Traphaco sản xuất.
STT Lượng bột cđn M; (mg) Diện tích píc Si Hăm lượng viín Xj (mg/v) Hăm lượng % viín (C%) Câc số liệu thống kí 1 668,5 2229732 49,61 99,22 ' X = 49,45 c % '= 98,90 s = 0,53 RSD% = 1,07 x=49,39 ± 0,66 2 670,0 2261091 50,12 100,24 3 663,5 2196079 49,23 98,46 4 671,5 2245982 49,60 99,20 5 670,0 2196579 48,69 97,38 Cc = 4,02 (mg/ml); Sc = 2247687; Mv = 335 (mg); H = 99,15%; m = 50 (mg/v); t(0,9 5;4) = 2,78; 8 = 0,66.
* Viín nĩn artesunat do công ty Mekopha sản xuất: v
Bảng 2.6: Kết quả định lượng mẫu của công ty Mekopha sản xuất.
STT Lượng bột cđn M; (mg) Diện tích píc s, Hăm lượng viín X; (mg/v) Hăm lượng % viín (C%) Câc số liệu thống kí 1 536,0 2271951 49,89 99,78 X = 49,74 c% = 99,49 ô = 0,42 RSD% = 0,84 x=49,89 ± 0,52 2 536,8 2262437 49,45 98,90 3 533,5 2228699 49,17 98,34 4 536,1 2279693 50,06 100,12 5 533,6 2273119 50,15 o o u> o sc = 2273135; Mv = 268 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); Cc= 4,02 (mg/ml); t(0>95;4) = 2,78; 8 = 0,52.
* Viín nĩn Artesunat xí nghiệp 120 sản xuất:
Bảng 2.7: Kết quả định lượng mẫu của xí nghiệp 120.
STT Lượng bột cđn Mị (mg) Diện tích píc S; Hăm lượng viín Xi (mg/y) Hăm lượng % viín (C%) Câc số liệu thống kí 1 603,0 2132588 48,66 98,32 X = 49,73 c % = 99,67 s = 0,69 RSD% - 1,39 x=49,73 ± 0,86 2 604,8 2201288 50,02 100,04 3 608,8 2208831 49,78 99,56 4 602,0 2166947 49,65 99,30 5 610,9 2252636 50,56 101,12 sc = 2188989; Mv = 302 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); Cc= 4,02 (mg/ml); t(0,95;4) = 2,78; 8 = 0,86.
* Viín nĩn Artesunat do công ty Dược khoa sản xuất:
Bảng 2.8: Kết quả định lượng mẫu của công ty Dược khoa.
STT Lượng bột cđn Mị (mg) Diện tích píc Si Hăm lượng viín Xi (mg/v) Hăm lượng % viín (C%) Câc số liệu thống kí 1 536,1 2111103 49,58 99,16 X = 49,99 c % = 99,98 5 = 0,30 RSD% = 0,60 x=49,99 ± 0,37 2 543,9 2162031 49,84 99,68 3 536,3 2139632 50,02 100,04 4 540,0 2153458 50,11 100,22 ' 5 546,3 2195899 50,39 100,78 sc = 2162364; Mv = 270 (mg); H = 99,15% m = 50 (mg/v); Cc= 4,06 (mg/ml); t(0)95;4) = 2,78; £ = 0,37. 29
Theo quy định của Dược điển quốc tế (2003), hăm lượng artesunat phải đạt được nồng độ nằm trong khoảng 90% - 110% so với hăm lượng ghi trín nhên.
Kết luận: Căn cứ văo kết quả định lượng, có thể kết luận câc mẫu thuốc trín đều đạt tiíu chuẩn chất lượng theo tiíu chuẩn Dược điển vă được phĩp dùng để phục vụ công tâc điều trị bệnh sốt rĩt cho bệnh nhđn sốt rĩt.
2.2.3. Phương phâp đo quang phổ vùng tử ngoại
2.2.3.1. Xđy dựng phương phâp V
Tiến hănh quĩt phổ của artesunat sử dụng ethanol 90° vă NaOH 0,1 N để pha vă thuỷ phđn artesunat chuẩn.
Câch lăm: Cđn 25 mg artesunat chuẩn cho văo bình định mức 50 ml. Hoă tan trong ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50 ml. Bổ sung NaOH 0,1 N văo cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Thuỷ phđn dung dịch trín ở nhiệt độ 50° ± l°c
trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh. Tiến hănh quĩt phổ của dung dịch trín trong khoảng bước sóng từ 400 nm đến 190 nm. Kết quả thu được cho thấy artesunat sau khi pha bằng ethanol 90° vă thuỷ phđn 60 phút trong NaOH 0,1 N có cực đại hấp thụ ở bước sóng 289 nm.
2.2.3.2. Khảo sât khoảng tuyến tính của phương phâp
Tiến hănh pha 6 dung dịch artesunat chuẩn trong ethanol 90°, rồi pha loêng câc dung dịch năy trong NaOH 0,1 N để được câc dung dịch có nồng độ khâc nhau lần lượt lă: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 mg/ml. Thuỷ phđn câc dung dịch trín trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50 ± 1° c trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh, tiến hănh đo độ hấp thụ của câc dung dịch trín trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dăy 1 cm. Mẫu trắng lă NaOH 0,1 N được xử lý trong cùng điều kiện với câc dung dịch trín.
2.2.3.3. Khảo sât độ lặp lại của phương phâp
Dung dịch chuẩn: Cđn chính xâc một lượng artesunat chuẩn khoảng 130 mg cho văo bình định mức 100 ml. Thím văo bình 70 ml ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50 ml, thím dung dịch NaOH 0,1 N cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều.
Dung dịch thử: Cđn 20 viín artesunat, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn chính xâc một lượng bột viín tương đương 130 mg artesunat cho văo bình định mức lOOml. Thím văo bình 70 ml ethanol 90°, siíu đm cho tan hết. Bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50 ml, thím dung dịch NaOH 0,1 N cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều.
Câch tiến hănh: Thuỷ phđn câc dung dịch trín ở nhiệt độ 50 ± l°c trong 60 phút. Lăm nguội nhanh bằng nước lạnh, tiến hănh đo độ hấp thụ câc dung dịch trín trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm. Mẫu trắng lă NaOH 0,1 N cũng được xử lý trong cùng điều kiện với câc dung dịch trín.
Nồng độ artesunat có trong 1 viín được tính theo công thức:
c% = Dt Mc — xH D c . Mt .m Trong đó Dt Dc m; m Mt Mc H Độ hấp thụ của dung dịch thử. Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. Khối lượng trung bình viín (mg). Hăm lượng của viín (mg/v). Khối lượng bột đê cđn (mg).
Khối lượng artesunat chuẩn đê cđn (mg). Hăm lượng artesunat chuẩn. v
Thực hiín 5 lần định lượng, kết quả được ghi trong bảng 2.10.
2.2.3.4. Khảo sât tính đúng của phương phâp
Để xâc định tính đúng của phương phâp chúng tôi tỉến hănh định lượng bằng phương phâp thím chuẩn. Câch thức tiến hănh được thực hiện như sau:
Dung dịch thử: Cđn 20 viín, tính khối lượng trung bình viín, nghiền thănh bột mịn. Cđn một lượng bột viín tương đương khoảng 100 mg artesunat, cho văo bình định mức 100 ml. Thím 70 ml ethanol 90° văo bình định mức, siíu đm cho tan hết, bổ sung ethanol 90° cho vừa đủ đến vạch vă lắc đều. Lọc nhanh dung dịch trín qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xâc 5 ml