Tại bộ môn Vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được với 1 0 chủng vi khuẩn kiểm định.
Nguyên tắc :
Dựa trên sự khuếch tán của chất thử vào môi trường dinh dưỡng có chứa vi sinh vật kiểm định. Nếu chất thử có hoạt tính kháng khuẩn sẽ tạo ra vòng vô khuẩn tỷ lệ thuận với logarit nồng độ tương ứng.
Vi khuẩn kiểm định:
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 10 chủng vi khuẩn bao gồm 5
chủng Gram (+ ), 5 chủng Gram (-). - Vi khuẩn Gram (+)
Bacillus cereus ATCC 9946 BacỉUus pumilus ATCC 6633 Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcinalutea ATCC 9341
Staphylococcus aureus ATCC ỉ 228 - Vi k h u ẩ n Gram (-)
Escherichia coli ATCC 25922 Proteus mirabilis BV 108
Pseudomonas aeruginosa VM 201 Salmonella typhi DT 220
Chất thử:
Gồm các chất I, II, III, IV, V, VII, pha ở nồng độ 4mg/lml trong dung môi DMF. Mẫu chứng đối với vi khuẩn Gram (+)là Penicilin , đối với vi khuẩn Gram (-) là Gentamycin. Sau đó tẩm các dung dịch trên vào các khoanh giấy lọc đường kính 6mm (đã tiệt trùng ), sấy khô ở nhiệt độ khoảng 40°c, làm như vậy 3 lần cho khoanh giấy bão hoà chất thử và chất chứng.
Môi trường kiểm định. - Môi trường canh thang:
Cao thịt 0,3g
Pepton 0,5g
NaCl 0,5g
Nước vừa đủ lOOml - Môi trường thạch thưòỉng:
Môi trưcỉng canh thang 1200ml
Thạch 192g
Các môi trường nuôi cấy được hấp tiệt trùng ở 120°c trong vòng 30 phút
trước k h i sử d ụ n g .
Các chủng vi sinh vật trước khi dùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Sau đó được chế thành nhũ dịch vi sinh vật có nồng độ 10'^-
1 0'^ tếbào/lml.
Tiến h à n h :
Chế nhũ dịch vi khuẩn bằng cách dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24h, cấy truyền vào một ống nghiệm khác có chứa 2,5ml
môi trường canh thang, các ống nghiệm này được đặt trong tủ ấm ở 37°c trong
24h. Sau đó lấy ra sử dụng.
Sử dụng các đĩa petri có đường kính như nhau, cho vào mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường thạch thường chứa vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ 2,5 ml nhũ dịch vi sinh vật trong 100 ml môi trường ở 40°c - 50®c.
Để nguội, đặt các khoanh giấy lọc có tẩm chất chuẩn và chất thử vào các đĩa theo sơ đồ đã định sẵn.
Các đĩa petri trên được nuôi cấy ở 3TC trong 18-24 giờ Mẫu thử được làm trên 3 đĩa với mỗi loại vi khuẩn.
Kết quả:
Sau khi nuôi cấy, đo vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer. Kết quả được đáng giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và xử lý theo công thức.
n i=l
í/=1Ễ(<I>Í-<!>)'
n - ì
Oi : các đường kính vòng vô khuẩn thứ i đo được, o : là đường kính trung bình vòng vô khuẩn, n : số thí ngiệm song song,
s : độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh. Kết quả thí nghiệm được ghi ở bảng 7.
Hình ảnh minh hoạ tác dụng kháng khuẩn được trình bày ở phụ lục 17-21.
Nhân xét:
ở nồng độ 4mg/ml chỉ có 2 chất (V, VII) có tác dụng kháng khuẩn, trong đó chất V có tác dụng rất yếu đối với 2 chủng vi khuẩn {Bacillus cereus , Bacillus subtilỉs), riêng với chất VII có tác dụng khá rõ rệt với 6 chủng vi khuẩn, 4 chất còn lại (I-IV) không có tác dụng.
Bảng 7: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được
ị Nồng độ chất thử : 4 mg/mỉ (dung môi DMF). Đường kính vòng vô khuẩn tính theo mm. Không có tác dụng: - )
Chủng ~ Chất v s v — n III IV V VII Ghứng p G Bacillus cereus o (mm) - - - - 9,54 12,48 19,50 s 0,08 0.92 0,92 Bacillus pumilus o (mm) - - - 15,12 - s 0,24 Bacillus subtilis o (mm) - - - - 9,60 12,69 19,10 s 0,03 0,48 0,35 Staphylococcus aureus o (mm) - - - 16,17 19,21 s 0,32 0,35 Sarcina lutea o (mm) - - - 19,12 s 0,24 Escherichia coli <x> (mm) - - - - - - 10,81 s 0,84 Pseudomonas aeruginosa o (mm) - - - 13,46 s 0,73 Proteus mirabilis o (mm) - - - 13,46 24,14 s 0,33 0,47 Shigella flexneri o (mm) - - - - - 12,25 12,81 s 0,29 0,76 Salmonella typhi o (mm) - - - - - - - s U)
o (mm) : Đường kính vòng vô khuẩn, s : Độ lệch chuẩn
p : Penicillin G : Gentamycin