1. 5 Tóm tắt các tiêu chuẩn cơ bản trong DĐVIV của các vị thuốc
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát các đặc điểm vi học của các vị thuốc
- Mô tả: Quan sát trực tiếp vị thuốc để mô tả, so sánh với đặc điểm của vị thuốc được mô tả trong DĐVN IV, vị thuốc chuẩn ( nếu có) để đánh giá.
- Vi phẫu: Cắt, nhuộm, soi vi, mô tả đăc tiến hành theo các tài liệu thực tập Dl của Bộ môn DL, thực tập của bộ môn thực vật. Soi trên kính hiển vi Leica (Đức)/ Labomed [10].
- Soi bột: Tán dược liệu thành bột mịn, quá trình tiến hành và soi trên kính hiển vi Leica (Đức)/ Labomed [10].
Bột và vi phẫu có so sánh với DL chuẩn (nếu có).
2.2.2. Định tính, định lượng, SKLM, hàm lượng chất chiết được
Tiến hành theo các phương pháp hóa thực vật thường quy ghi trong các tài liệu [9],[10] và các phương pháp của vị thuốc đó trong DĐVN IV [1], DĐTQ [13].
2.2.3. Xác định các chỉ tiêu hóa lí
Độ tro: Theo phương pháp nung.
Độ ẩm: Gồm 2 phương pháp
- Mất khối lượng nước do làm khô.
Chƣơng3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trên cơ sở các nguyên liệu đã thu nhập được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo PP đã nêu ở trên và thu được các kết quả như sau:
3.1.Vị thuốc Đƣơng quy ( Radix Angelicae sinensis) 3.1.1.Mô tả vị thuốc
- Mặt ngoài màu nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc.
- Mặt cắt ngang màu vàng ngà có vân tròn.
- Mùi thơm đặc biệt, vị ngọt, cay, hơi đắng.
Hiện nay trên thị trường phần lớn người ta bán Đương quy dạng phiến (hình 3.1).
Hình 3.1. Ảnh mô tả vị thuốc Đương quy dạng phiến
Nhận xét : Sau khi quan sát, so sánh với các đặc điểm của Đương quy được mô tả trong DĐVN IV [1], thấy hoàn toàn giống nhau.
3.1.2.Soi bột
Tiến hành: Lấy một lượng nhỏ bột ( qua rây 250 µm), cho vào một giọt nước
hoặc glycerin đã có sẵn trên lam kính, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm nước/
glycerin, đậy lam kính, quan sát dưới KHV ở các vật kính khác nhau. Bột Đương quy có các đặc điểm được ghi ở hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh một số đặc điểm soi bột Đương quy
Ghi chú: 1. Mảnh mạch; 2. Mô mềm; 3. Tinh bột
Nhận xét: Các đặc điểm của bột Đương quy giống với các đặc điểm được mô tả trong DĐVN IV[1].
3.1.3. Sắc kí lớp mỏng
Để phù hợp với điều kiện thực nghiệm chúng tôi tiến hành chiết lạnh Đương quy với Ethanol 96% và khảo sát tìm hệ dung môi thích hợp.
- Chuẩn bị dịch chấm SK: Dung môi Ethanol.
DL được làm thành bột thô, cho 5 gam vào bình nón (250ml) sạch, chiết lạnh với dung môi Ethanol 96% 3 lần mỗi lần 1 giờ, gộp toàn bộ dịch đem lọc, ly tâm rồi cô đặc còn 1 (ml), đem chấm SK.
- Chuẩn bị bản mỏng chấm SK: Bản mỏng Silicagen GF 254 (Merck) đã được tráng
sẵn, hoạt hóa bản mỏng ở 110oC/ 60’, để nguội, bảo quản trong bình hút ẩm.
- Khai triển: Chấm DC lên bản mỏng với 1 lượng nhất định, để bay hết DM, chạy SK.
- DM khai triển: Khảo sát trên một số hệ DM, chọn hệ tách tốt hơn cả để ghi lại KQ.
A2: n- hexan : CHCl3 (5:1) .
A3: cyclohexan : EtOAc (8:2) (9:5).
A4: benzen : EtOAc (95:5) (19:1).
A5: cyclohexan : EtOAc : aceton (7:2:1).
A6: CHCl3 : EtOAc : HCOOH (5 : 5 : 1).
- Triển khai DM chạy từ dưới lên, sau khi chạy SK xong, để bản mỏng khô, đem soi
dưới ASTN 366 nm, 254 nm thấy hệ A5 có khả năng tách được nhiều vết & rõ hơn so với các hệ còn lại. KQ được tóm tắt ở hình 3.3.
H1. SKLM 254 nm H2. SKLM 366nm Hình 3.3. Sắc kí của Đương quy ở bước sóng 254 nm và 366 nm
3.1.4. Độ ẩm
Xác định độ ẩm của Đương quy theo PP cất với dung môi.
Tiến hành:
Rửa sạch ống hứng và ống sinh hàn với nước, sấy làm khô. Thêm 200 ml toluen
và khoảng 2 ml nước vào bình cầu khô. Cất khoảng 2 giờ, để nguội trong 30 phút, đọc thể tích nước cất được ở ống hứng (V1).
Thêm vào bình cầu một lượng Đương quy khoảng 13,33 – 20 g( bột thô) có chứa khoảng 2 - 3 ml nước. Thêm vài mảnh đá bọt. Đun nóng nhẹ trong 15 phút, cất cho đến
thành trong ống sinh hàn rồi cất thêm 5 phút nữa, để nguội. Nếu có những giọt nước
còn đọng trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen để rửa kéo xuống. Để yên đến
khi phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng (V2). Làm 3 mẫu lấy kết quả
trung bình.
Độ ẩm các mẫu thử theo công thức (1): H= m V V ) ( 100 2 1 (1) Trong đó:
H : độ ẩm của Đương quy(%).
V1: thể tích nước cất được sau lần cất đầu (ml). V2: thể tích nước cất được sau hai lần cất (ml). m: Số mẫu đã cân đem thử (g).
Kết quả được ghi ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của Đương quy
Mẫu M (g) V1 (ml) V2 (ml) H (%)
1 13,470 1,92 2,90 7,28
2 18,503 1,90 3,20 7,03
3 14,214 1,88 2,84 6,75
TB 7,02
Yêu cầu DĐVN IV: Không quá 15,0%.
Nhận xét: Độ ẩm của Đương quy đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.5. Tro không tan trong acid
Xác định tro không tan trong acid của Đương quy có độ ẩm H= 7,02 %.
Tiến hành:
Chén sứ được rửa sạch nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm
sấy khoảng 5 giờ ở 100 – 105 oC rồi đem nung ở lò nung 600 25 oC cho tới tro toàn phần.
Cho 25 ml acid HCl 2M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan cho vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng, làm khô rồi
nung ở 500oC đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân. Làm
6 mẫu để lấy kết quả trung bình.
Tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid được tính theo công thức (2):
(2)
Trong đó:
X: độ ẩm của Đương quy (%). M0: khối lượng chén nung ( g ).
M1: khối lượng Đương quy( g).
M2: khối lượng chén nung và tro( g).
Kết quả được ghi ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả định lượng tro không tan trong acid Đương quy
Mẫu M0(g) M1(g) M2(g) X(%) 1 22,390 2,003 22,422 1,72 2 20,881 2,014 20,905 1,28 3 21,275 2,091 21,294 0,98 4 21,709 2,075 21,729 1,04 5 25,340 2,004 25,365 1,34 6 22,456 2,078 22,48 1,65 TB 1.34
Yêu cầu của DĐVN IV: Không quá 2,00%.
3.1.6. Chất chiết trong dƣợc liệu
Xác định lượng chất chiết trong Đương quy theo phương pháp chiết nóng.
Dung môi: Ethanol 50%. Đương quy có độ ẩm H= 7,02 %.
Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 2,00g bột Đương quy( bột nửa thô) cho vào bình nón 250 ml. Thêm chính xác 50 ml dung môi, đậy kín, cân chính xác khối lượng, để yên 1 giờ. Đun sôi nhẹ hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng dung môi để bổ sung phần bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. làm như vậy thêm 2 lần nữa. Gộp dịch lọc 3 lần lại.
Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách
thủy đến cắn khô, sấy cắn ở 1500C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30
phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Làm 3 mẫu để lấy kết quả trung bình. Hàm lượng chất chiết được bằng nước của DL tính theo công thức (3).
(3)
Trong đó:
C : hàm lượng chất chiết được của Đương quy (%). M2: tổng khối lượng cốc và cắn ( g).
M1: khối lượng cốc ( g).
M: khối lượng DL đem thử( g). H : độ ẩm Đương quy (%).
Kết quả được ghi ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng chất chiết được bằng Ethanol trong Đương quy Mẫu M (g) M1 (g) M2 (g) C (%) 1 2,002 50,090 50,612 84,13 2 2,018 50,214 50,733 82,98 3 2,034 51,360 50,905 86,45 TB 84,52
Yêu cầu DĐVN IV: Không ít hơn 40,00% tính theo dược liệu khô kiệt.
Nhận xét: H.lượng chất chiết trong ethanol của Đương quy đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
Nhận xét chung: Từ các đặc điểm đã kiểm tra ở trên, về cơ bản vị thuốc Đương quy đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.2.Vị thuốc Câu kỉ tử ( Fructus Lycii). 3.2.1. Mô tả vị thuốc
- Quả hình trứng dài hay trái xoan. Mặt ngoài màu đỏ cam, mềm, nhăn nheo. Gốc quả
có vết cuống quả màu trắng còn sót lại, đỉnh quả có điểm nhỏ hơi nhô lên.
- Quả có nhiều hạt nhỏ hình thận dẹt, hai mặt hơi cong phồng hoặc có một mặt lõm.
Hạt màu vàng nâu có nội nhũ, rốn hạt là một điểm lõm nhỏ ở mép hạt.
- Chất mềm, vị ngọt hơi chua. ( hình 3.4).
H1. Quả Câu kỉ tử H2. Hạt Câu kỉ tử
Nhận xét : Sau khi quan sát, so sánh với các đặc điểm của Câu kỉ tử được mô tả trong DĐVN IV [1], thấy hoàn toàn giống nhau.
3.2.2. Soi bột
Tiến hành: tương tự như soi bột Đương quy.
Kết quả: Bột Câu kỉ tử gồm các đặc điểm được ghi ở hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh một số đặc điểm soi bột Câu kỉ tử
Chú thích: 1.Mảnh mạch xoắn; 2.Mảnh tế bào nội nhũ;
3.Tế bào vỏ quả hình đa giác hoặc hình chữ nhật, to nhỏ không đều; 4.Tế bào mô cứng; 5.Tinh thể hình kim; 6.Các giọt dầu màu vàng cam
Nhận xét: Các đặc điểm của bột Câu kỉ tử giống với các đặc điểm được mô tả trong DĐVN IV[1].
3.2.3. Định tính
Tiến hành:
a. 10 ml
365 nm.
Kết quả ( phù hợp với yêu cầu DĐVN IV).
b. 2%(TT).
3.2.4. Sắc kí lớp mỏng
- Chuẩn bị dịch chấm SK:
Dịch chiết 1: chiết với Ethanol như Đương quy.
Dịch chết 2:
- Dung môi: CHCl3 : Methanol (2:1).
DL được làm thành bột thô, cho 5 gam vào bình nón (250ml) sạch, ngâm lạnh với 20ml hỗn hợp dung môi trên trong 5 giờ, lọc lấy dịch, ly tâm rồi cô đặc còn 1 (ml), đem chấm SK.
DC để chấm SK phải đảm bảo các yêu cầu sau: trong suốt, không lắng cặn, không phân lớp, không bị nhũ hóa, không tạo váng và đồng nhất về màu sắc.
- Chuẩn bị bản mỏng chấm SK: bản mỏng silicagen GF 254 (Merck) đã được tráng
sẵn, hoạt hóa bản mỏng ở 110oC/ 60’, để nguội, bảo quản trong bình hút ẩm.
- Khai triển: Chấm DC lên bản mỏng với 1 lượng nhất định, để bay hết DM, tiến hành chạy SK.
- DM khai triển: khảo sát trên một số hệ DM, chọn hệ tách tốt hơn cả để ghi lại KQ.
A1: CHCl3 : EtOAc : HCOOH (2 : 3 : 1).
A2: CHCl3 : aceton : HCOOH (10 : 2,2 : 1,1). .
A3: CHCl3 : EtOAc (9:1).
A4: Methanol : cloroform (9:1).
A5: Methanol : cloroform : aceton (5: 5 :1).
A6: CHCl3 : Methanol : NH4OH ( 50: 9 :1).
A7: n- butanol : CH3COOH : H2O ( 7: 2 : 1).
A8: Toluen : EtOAc : Aceton : HCOOH (5 : 2 : 2 : 1).
A9: Toluen : aceton: MeOH : dd NH3 đặc (10: 10: 1.5 : 1).
- Triển khai DM chạy từ dưới lên, sau khi chạy SK xong, để bản mỏng khô, đem soi dưới UV 366 nm, 254 nm thấy hệ A8 có khả năng tách được nhiều vết & rõ hơn so với các hệ còn lại. KQ được tóm tắt ở hình 3.6.
H1 H2 H3 H4
Hình 3.6. Sắc kí của Câu kỉ tử ở bước sóng 254 nm và 366 nm
Ghi chú: H1: sắc kí dịch chiết 1 câu kỉ tử ở bước sóng 254nm
H2: sắc kí dịch chiết 2 câu kỉ tử ở bước sóng 254 nm
H3: sắc kí dịch chiết 1 câu kỉ tử ở bước sóng 366 nm
H4: sắc kí dịch chiết 2 câu kỉ tử ở bước sóng 366 nm
3.2.5. Độ ẩm
Xác định độ ẩm của Câu kỉ theo phương pháp làm khô.
Tiến hành: DL tán thành bột mịn, đo độ ẩm bằng máy đo độ ẩm Precisa ở 105oC, với khối lượng bột chính xác khoảng 1,00g. Làm 3 mẫu để lấy kết quả trung bình.
Kết quả được ghi ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả xác định độ ẩm của Câu kỉ tử
Mẫu Khối lượng bột (g) Độ ẩm (%)
1 1,002 8,00
2 1,061 8,25
3 1,013 7,59
TB 7,95
Yêu cầu của DĐVN IV: Không quá 13,00%.
3.2.6. Tro toàn phần
Xác định tro toàn phần của Câu kỉ tử với độ ẩm H= 7,95 %.
Tiến hành:
Chén sứ được rửa sạch nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi
cân (M0). DL tán thành bột mịn cân chính xác khoảng 1 g rải đều vào chén nung, sấy
khoảng 5 giờ ở 100 – 105 oC rồi đem nung ở lò nung 600 25 oC. Sau mỗi lần nung,
lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Hợp dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi. Làm 6 mẫu để lấy kết quả trung bình.
Tỷ lệ phần trăm của tro được tính theo công thức (4):
(4)
Trong đó:
X: độ ẩm của Câu kỉ tử (%). M0: khối lượng chén nung ( g ). M1: khối lượng Câu kỉ tử( g).
M2: khối lượng chén nung và tro( g). H : Độ ẩm của Câu kỉ tử(%).
Kết quả được ghi ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả định lượng tro toàn phần của Câu kỉ tử
Mẫu M0(g) M1(g) M2(g) X(%)
1 25,652 2,001 25,712 3,26
2 21,046 2,037 21,100 2,93
3 22,439 2,013 22,477 2,05
5 20,912 2,053 2,055 2,91
6 30,324 2,022 2,022 1,83
TB 2,59
Yêu cầu của DĐVN IV: Không quá 5,00%.
Nhận xét: Tro toàn phần của Câu kỉ tử đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
1.1.2 3.2.7. Chất chiết trong dƣợc liệu
Xác định lượng chấy chiết trong Câu kỉ tử theo phương pháp chiết nóng.
Dung môi: Nước. Câu kỉ tử có độ ẩm H= 7,95 %.
Tiến hành: Tương tự xác định chất chiết trong dược liệu Đương quy.
Kết quả được ghi ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hàm lượng chất chiết được bằng Ethanol trong Câu kỉ tử
Mẫu M (g) M1 (g) M2 (g) C (%)
1 2,001 51,220 51,753 86,81
2 2,013 50,947 51,529 94,23
3 2,045 52,023 52,601 92,12
TB 91,05
Yêu cầu DĐVN IV: Không ít hơn 50,00% tính theo DL khô kiệt.
Nhận xét: H.lượng chất chiết trong ethanol của Câu kỉ tử đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
Nhận xét chung: Từ các đặc điểm đã kiểm tra ở trên, về cơ bản vị thuốc Câu kỉ tử đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.