2.2.2.1. Tiêm miễn dịch
Tiêm miễn dịch cho chuột được thực hiện qua hai liều tiêm cách nhau 21 ngày, các chuột sẽ được đánh dấu trước khi tiêm. Liều tiêm 0,1ml vắc xin hoặc giả dược theo đường tiêm dưới bắp đùi.
2.2.2.2. Phương pháp lấy máu thu huyết thanh miễn dịch
Mỗi chuột được lấy máu 3 lần.
Lần thứ nhất (M0) hay còn gọi là máu nền được lấy trước khi tiêm miễn dịch từ 0 đến 3 ngày.
Lần thứ hai (M1) vào ngày thứ 21 (3 tuần sau liều thứ nhất). Lần thứ ba (M2): ngày 35 (2 tuần sau liều thứ hai).
Thể tích mỗi lần lấy máu từ 0,5 đến 0,8 ml.
Phương pháp lấy máu: dùng pipet pasteur thủy tinh lấy máu. Đưa nhẹ nhàng đầu pipet vào khóe mắt chuột (dưới con ngươi), vào động mạch khoé mắt, xoáy nhẹ để máu từ từ chảy vào trong pipet pasteur. Khi đủ lượng máu cần lấy, rút pipet ra và cho máu vào tube nhựa đã ghi rõ thông tin.
Hình 2.1: Lấy máu chuột ở mắt.
Máu sau khi được lấy sẽ được để trong tủ ấm 30 phút. Sau đó cho vào tủ lạnh 2 – 80C trong 1,5 – 2 giờ để thu được lượng huyết thanh tối đa.
- Ly tâm tube máu ở 13000 vòng / 5 phút.
- Thu huyết thanh cho vào microtube được ghi đầy đủ thông tin. - Bảo quản huyết thanh ≤ -200C cho đến khi chuẩn độ.
2.2.2.3. Phương pháp chuẩn độ kháng thể HA (phương pháp ức chế ngưng kết hồng cầu)
Nguyên tắc:
- Kháng nguyên HA của virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loại động vật máu nóng như gà, gà tây, ngựa,....
- Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu HA sẽ ức chế khả năng này, ngăn không cho HA ngưng kết hồng cầu, phản ứng này xảy ra ngược với phản ứng ngưng kết hồng cầu nên được gọi là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu. Dựa vào phản ứng này để xác định hiệu giá kháng thể HA hay được gọi là thử nghiệm HAI.
- Huyết thanh chứa kháng thể kháng HA được pha loãng bậc 2 thành các độ pha khác nhau trên phiến 96 giếng, đáy chữ V. Sau đó bổ sung kháng nguyên HA chuẩn. Sau thời gian phản ứng (30 phút), bổ sung thêm dung dịch hồng cầu ngựa 1%. Phản ứng dương tính nếu kháng thể ức chế hoạt động của HA làm cho hồng
cầu không bị ngưng kết. Ngược lại, phản ứng âm tính khi kháng nguyên không bị ức chế và gây ngưng kết hồng cầu.
- Đơn vị hiệu giá kháng thể HA (HAI) là nghịch đảo độ pha loãng cao nhất của huyết thanh vẫn còn ức chế hồng cầu và không gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.
Xử lí huyết thanh
- Mỗi mẫu huyết thanh được xử lý lặp trong 2 ống riêng biệt.
- Cho vào mỗi ống 0,1 ml huyết thanh và 0,1 ml trypsin 0,4%. Ủ hỗn hợp ở 56oC trong 30 phút.
- Lấy hỗn hợp ra, để nguội ở nhiệt độ phòng sau đó bổ sung 0,3 ml kali periodat 1/90M, để tiếp 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 0,5 ml dụng dịch glyxeryl 0,6% trong nước muối sinh lý. - Như vậy huyết thanh đã được xử lý và pha loãng 1/10.
- Huyết thanh đã xử lý được dùng làm phản ứng HAI (có thể bảo quản ở tủ lạnh - 20oC).
Chuẩn độ kháng nguyên
- Lấy 3 hàng A, B và C trên phiến chuẩn độ 96 giếng. Cho vào mỗi giếng 50 µl đệm PBS. Hàng A và B dùng để chuẩn độ kháng nguyên, hàng C dùng làm chứng hồng cầu.
- Thêm vào giếng A1 và B1 mỗi giếng 50 µl kháng nguyên cần chuẩn độ. Trộn đều. - Chuyển 50 µl từ A1,B1 sang A2,B2. Trộn đều. Tiếp tục chuyểnnhư thế cho đến
A12,B12. Loại bỏ 50 µl của A12,B12
- Thêm 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào tất cả các giếng. Lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.
- Đọc kết quả:
o Dương tính (+) : hồng cầu ngưng kết.
o Âm tính (-) : hồng cầu không ngưng kết.
o Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn còn gây ngưng kết hồng cầu.
o Điều kiện để phản ứng có giá trị tin cậy: chứng hồng cầu âm tính.
- Sau khi đọc kết quả ghi nhận hiệu giá HA của dung dịch kháng nguyên để làm căn cứ pha kháng nguyên thành dung dịch có 8 HA (ví dụ có chuẩn độ hiệu giá là 1280.
Để pha thành dung dịch 8 HA/50 µl sẽ pha loãng 160 lần: 1280:8 = 160:1. Tức là pha 1 ml kháng nguyên + 159 ml đệm PBS).
Kiểm tra kháng nguyên 8 HA
- Cho vào tất cả các giếng 50 µl PBS vào tất cả ở hàng A, B và C trong phiến. - Cho 50 µl kháng nguyên vừa pha vào 2 giếng A1 B1 trộn đều, hút lấy 50 µl từ A1
B1 sang 2 giếng A2 B2, trộn đều. Tiếp tục pha loãng bậc hai đến hai giếng A6 B6. Bỏ 50 µl ở A6 B6. Như vậy là kháng nguyên đã được pha loãng bậc 2 từ độ pha 1/2 đến 1/64.
- Cho 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào tất cả các giếng ở 3 hàng A, B và C. - Lắc đều và để yên trong 60 phút.
- Đọc kết quả: dung dịch kháng nguyên có 8 HA khi:
o Chứng hồng cầu: không ngưng kết (âm tính).
o Các giếng A1 B1 đến A3 B3: hồng cầu ngưng kết (phản ứng dương tính ở độ pha 1/8 kháng nguyên và gây ngưng kết hồng cầu).
o Các giếng A4 B4 đến A6 B6: hồng cầu không ngưng kết.
- Nếu dung dịch kháng nguyên không đạt yêu cầu 8 HA thì phải pha lại và kiểm tra đến khi đạt được nồng đồ kháng 8 HA.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) xác định kháng thể HAI
- Các mẫu huyết thanh đã được xử lí và pha loãng 1/10 sẽ được phân bố vào các giếng, mỗi mẫu được phân bố 2 cột từ cột 1 – 10, như vậy 1 phiến sẽ được 5 mẫu, cột 11 – 12 sẽ là chứng kháng nguyên và chứng hồng cầu.
- Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng trừ các giếng ở hàng A.
- Cho 50 µl huyết thanh thử đã xử lí tương ứng vào tất cả các giếng ở hàng A. - Pha loãng bậc 2 bằng cách chuyển 25 µl từ A vào hàng tiếp sau trộn đều và lần
lượt đến hàng H rồi hút bỏ 25 µl. Như vậy huyết thanh đã được pha loãng bậc 2 từ độ pha 1/10 (hàng A) đến 1/1280 (hàng H), mỗi giếng chứa 25 µl.
- Cho 25 µl kháng nguyên 8 HA vào tất cả các giếng có huyết thanh đã pha loãng trong phiến.
- Lắc đều và để yên trong 30 phút.
- Thêm vào tất cả các giếng này 50 µl hồng cầu ngựa 1% để trong 60 phút để xem kết quả.
o Từ hàng E đến H làm chứng hồng cầu: 50 µl hồng cầu, 50 µl PBS.
o Từ hàng A đến D làm chứng kháng nguyên: 50 µl PBS vào tất cả các giếng, cho 50 µl kháng nguyên vào hàng A và pha loãng bậc 2 đến hàng D, thêm 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào lắc đều và để yên trong 60 (nên thêm cùng lúc với mẫu để đọc kết quả cùng lúc).
Bảng 2.3: Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/10 A HT1 HT1 HT2 HT2 HT3 HT3 HT4 HT4 HT5 HT5 KN KN 1/20 B KN KN 1/40 C KN KN 1/80 D KN KN 1/160 E HC HC 1/320 F HC HC 1/640 G HC HC 1/1280 H HC HC Đọc kết quả:
- Dương tính (+): kháng nguyên bị ức chế không gây ngưng kết hồng cầu. - Âm tính (-): kháng nguyên không bị ức chế và gây ngưng kết hồng cầu. - Chưng hồng cầu: hồng cầu không bị ngưng kết.
- Chưng kháng nguyên: hồng cầu phải ngưng kết đến hàng C (độ pha loãng 1/8). - Hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là giá trị ngược của độ pha
loãng cao nhât của huyết thanh mà vẫn còn gây ức chế ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.
Âm tính (-) Dương tính (+)
Hình 2.3: Kết quả thí nghiệm HAI trên phiến.