2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin dự tuyển thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3 được thực hiện đối với hai loại vắc xin IVACFLU - A/H5N1 hấp phụ hydroxyt nhôm, lô số 010215 (loại 15 µg HA/ 0,5 ml) và 040215 (loại 30 µg HA/ 0,5 ml). Nghiên cứu sử dụng hai loại vắc xin IVACFLU - A/H5N1 tương ứng không hấp phụ với hydroxyt nhôm lô số 010215/B (loại 15 µg HA/ 0,5 ml) và 040215/B (loại 30 µg HA/ 0,5 ml) để đối chứng.
Tính ổn định sinh miễn dịch được tiến hành đối với các lô vắc xin 010813, 020813, 030813 có hàm lượng kháng nguyên 15 µg HA/liều, bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 3oC. Nghiên cứu được tiến hành tại các thời điểm vắc xin được bảo quản 6 tháng, 12 tháng, 18 tháng ở nhiệt độ 5 ± 3oC.
Thực hiện phân nhóm chuột: Mỗi một lô vắc xin cần 3 nhóm chuột nhắt tương ứng với 3 nồng độ vắc xin được miễn dịch, mỗi nhóm gồm 16 con (tổng cộng 48 chuột cho 1 vắc xin). Trong mỗi nghiên cứu đều có một nhóm chứng âm gồm 8 chuột tiêm PBS.
Mỗi một chuột của 1 nhóm ở các nồng độ tương ứng được tiêm bắp 2 lần vào ngày 0 và ngày 21. Chuột được lấy máu từng con vào các ngày -1 đến -3 (Máu nền – M0), ngày 21 (Máu 1 – M1) và ngày 35 (Máu 2 – M2).
Bảng 2.1: Thiết kế nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm IVACFLU - A/H5N1 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3.
Nhóm chuột SL chuột/ nhóm Vắc xin Độ pha Liều tiêm/chuột µg HA/chuột Ngày tiêm Ngày lấy máu 1 16 010215 1 0,1ml 3 0, 21 0, 21, 35 2 16 1/2 1,5 3 16 1/4 0,75 4 16 010215B 1 3 5 16 1/2 1,5 6 16 1/4 0,75 7 16 040215 1/2 3 8 16 1/4 1,5 9 16 1/8 0,75 10 16 040215B 1/2 3 11 16 1/4 1,5 12 16 1/8 0,75 13 8 PBS
Bảng 2.2: Thiết kế nghiên cứu tính ổn định sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1. Nhóm chuột SL chuột/ nhóm Vắc xin Độ pha Liều tiêm/chuột µg HA/chuột Ngày tiêm Ngày lấy máu 1 16 010813 1 0,2ml 3 0, 21 0, 21, 35 2 16 1/2 1,5 3 16 1/4 0,75 4 16 020813 1 3 5 16 1/2 1,5 6 16 1/4 0,75 7 16 030813 1 3 8 16 1/2 1,5 9 16 1/4 0,75 10 16 PBS
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 2.2.2.1. Tiêm miễn dịch 2.2.2.1. Tiêm miễn dịch
Tiêm miễn dịch cho chuột được thực hiện qua hai liều tiêm cách nhau 21 ngày, các chuột sẽ được đánh dấu trước khi tiêm. Liều tiêm 0,1ml vắc xin hoặc giả dược theo đường tiêm dưới bắp đùi.
2.2.2.2. Phương pháp lấy máu thu huyết thanh miễn dịch
Mỗi chuột được lấy máu 3 lần.
Lần thứ nhất (M0) hay còn gọi là máu nền được lấy trước khi tiêm miễn dịch từ 0 đến 3 ngày.
Lần thứ hai (M1) vào ngày thứ 21 (3 tuần sau liều thứ nhất). Lần thứ ba (M2): ngày 35 (2 tuần sau liều thứ hai).
Thể tích mỗi lần lấy máu từ 0,5 đến 0,8 ml.
Phương pháp lấy máu: dùng pipet pasteur thủy tinh lấy máu. Đưa nhẹ nhàng đầu pipet vào khóe mắt chuột (dưới con ngươi), vào động mạch khoé mắt, xoáy nhẹ để máu từ từ chảy vào trong pipet pasteur. Khi đủ lượng máu cần lấy, rút pipet ra và cho máu vào tube nhựa đã ghi rõ thông tin.
Hình 2.1: Lấy máu chuột ở mắt.
Máu sau khi được lấy sẽ được để trong tủ ấm 30 phút. Sau đó cho vào tủ lạnh 2 – 80C trong 1,5 – 2 giờ để thu được lượng huyết thanh tối đa.
- Ly tâm tube máu ở 13000 vòng / 5 phút.
- Thu huyết thanh cho vào microtube được ghi đầy đủ thông tin. - Bảo quản huyết thanh ≤ -200C cho đến khi chuẩn độ.
2.2.2.3. Phương pháp chuẩn độ kháng thể HA (phương pháp ức chế ngưng kết hồng cầu)
Nguyên tắc:
- Kháng nguyên HA của virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loại động vật máu nóng như gà, gà tây, ngựa,....
- Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu HA sẽ ức chế khả năng này, ngăn không cho HA ngưng kết hồng cầu, phản ứng này xảy ra ngược với phản ứng ngưng kết hồng cầu nên được gọi là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu. Dựa vào phản ứng này để xác định hiệu giá kháng thể HA hay được gọi là thử nghiệm HAI.
- Huyết thanh chứa kháng thể kháng HA được pha loãng bậc 2 thành các độ pha khác nhau trên phiến 96 giếng, đáy chữ V. Sau đó bổ sung kháng nguyên HA chuẩn. Sau thời gian phản ứng (30 phút), bổ sung thêm dung dịch hồng cầu ngựa 1%. Phản ứng dương tính nếu kháng thể ức chế hoạt động của HA làm cho hồng
cầu không bị ngưng kết. Ngược lại, phản ứng âm tính khi kháng nguyên không bị ức chế và gây ngưng kết hồng cầu.
- Đơn vị hiệu giá kháng thể HA (HAI) là nghịch đảo độ pha loãng cao nhất của huyết thanh vẫn còn ức chế hồng cầu và không gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.
Xử lí huyết thanh
- Mỗi mẫu huyết thanh được xử lý lặp trong 2 ống riêng biệt.
- Cho vào mỗi ống 0,1 ml huyết thanh và 0,1 ml trypsin 0,4%. Ủ hỗn hợp ở 56oC trong 30 phút.
- Lấy hỗn hợp ra, để nguội ở nhiệt độ phòng sau đó bổ sung 0,3 ml kali periodat 1/90M, để tiếp 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 0,5 ml dụng dịch glyxeryl 0,6% trong nước muối sinh lý. - Như vậy huyết thanh đã được xử lý và pha loãng 1/10.
- Huyết thanh đã xử lý được dùng làm phản ứng HAI (có thể bảo quản ở tủ lạnh - 20oC).
Chuẩn độ kháng nguyên
- Lấy 3 hàng A, B và C trên phiến chuẩn độ 96 giếng. Cho vào mỗi giếng 50 µl đệm PBS. Hàng A và B dùng để chuẩn độ kháng nguyên, hàng C dùng làm chứng hồng cầu.
- Thêm vào giếng A1 và B1 mỗi giếng 50 µl kháng nguyên cần chuẩn độ. Trộn đều. - Chuyển 50 µl từ A1,B1 sang A2,B2. Trộn đều. Tiếp tục chuyểnnhư thế cho đến
A12,B12. Loại bỏ 50 µl của A12,B12
- Thêm 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào tất cả các giếng. Lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.
- Đọc kết quả:
o Dương tính (+) : hồng cầu ngưng kết.
o Âm tính (-) : hồng cầu không ngưng kết.
o Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn còn gây ngưng kết hồng cầu.
o Điều kiện để phản ứng có giá trị tin cậy: chứng hồng cầu âm tính.
- Sau khi đọc kết quả ghi nhận hiệu giá HA của dung dịch kháng nguyên để làm căn cứ pha kháng nguyên thành dung dịch có 8 HA (ví dụ có chuẩn độ hiệu giá là 1280.
Để pha thành dung dịch 8 HA/50 µl sẽ pha loãng 160 lần: 1280:8 = 160:1. Tức là pha 1 ml kháng nguyên + 159 ml đệm PBS).
Kiểm tra kháng nguyên 8 HA
- Cho vào tất cả các giếng 50 µl PBS vào tất cả ở hàng A, B và C trong phiến. - Cho 50 µl kháng nguyên vừa pha vào 2 giếng A1 B1 trộn đều, hút lấy 50 µl từ A1
B1 sang 2 giếng A2 B2, trộn đều. Tiếp tục pha loãng bậc hai đến hai giếng A6 B6. Bỏ 50 µl ở A6 B6. Như vậy là kháng nguyên đã được pha loãng bậc 2 từ độ pha 1/2 đến 1/64.
- Cho 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào tất cả các giếng ở 3 hàng A, B và C. - Lắc đều và để yên trong 60 phút.
- Đọc kết quả: dung dịch kháng nguyên có 8 HA khi:
o Chứng hồng cầu: không ngưng kết (âm tính).
o Các giếng A1 B1 đến A3 B3: hồng cầu ngưng kết (phản ứng dương tính ở độ pha 1/8 kháng nguyên và gây ngưng kết hồng cầu).
o Các giếng A4 B4 đến A6 B6: hồng cầu không ngưng kết.
- Nếu dung dịch kháng nguyên không đạt yêu cầu 8 HA thì phải pha lại và kiểm tra đến khi đạt được nồng đồ kháng 8 HA.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) xác định kháng thể HAI
- Các mẫu huyết thanh đã được xử lí và pha loãng 1/10 sẽ được phân bố vào các giếng, mỗi mẫu được phân bố 2 cột từ cột 1 – 10, như vậy 1 phiến sẽ được 5 mẫu, cột 11 – 12 sẽ là chứng kháng nguyên và chứng hồng cầu.
- Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng trừ các giếng ở hàng A.
- Cho 50 µl huyết thanh thử đã xử lí tương ứng vào tất cả các giếng ở hàng A. - Pha loãng bậc 2 bằng cách chuyển 25 µl từ A vào hàng tiếp sau trộn đều và lần
lượt đến hàng H rồi hút bỏ 25 µl. Như vậy huyết thanh đã được pha loãng bậc 2 từ độ pha 1/10 (hàng A) đến 1/1280 (hàng H), mỗi giếng chứa 25 µl.
- Cho 25 µl kháng nguyên 8 HA vào tất cả các giếng có huyết thanh đã pha loãng trong phiến.
- Lắc đều và để yên trong 30 phút.
- Thêm vào tất cả các giếng này 50 µl hồng cầu ngựa 1% để trong 60 phút để xem kết quả.
o Từ hàng E đến H làm chứng hồng cầu: 50 µl hồng cầu, 50 µl PBS.
o Từ hàng A đến D làm chứng kháng nguyên: 50 µl PBS vào tất cả các giếng, cho 50 µl kháng nguyên vào hàng A và pha loãng bậc 2 đến hàng D, thêm 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào lắc đều và để yên trong 60 (nên thêm cùng lúc với mẫu để đọc kết quả cùng lúc).
Bảng 2.3: Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/10 A HT1 HT1 HT2 HT2 HT3 HT3 HT4 HT4 HT5 HT5 KN KN 1/20 B KN KN 1/40 C KN KN 1/80 D KN KN 1/160 E HC HC 1/320 F HC HC 1/640 G HC HC 1/1280 H HC HC Đọc kết quả:
- Dương tính (+): kháng nguyên bị ức chế không gây ngưng kết hồng cầu. - Âm tính (-): kháng nguyên không bị ức chế và gây ngưng kết hồng cầu. - Chưng hồng cầu: hồng cầu không bị ngưng kết.
- Chưng kháng nguyên: hồng cầu phải ngưng kết đến hàng C (độ pha loãng 1/8). - Hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là giá trị ngược của độ pha
loãng cao nhât của huyết thanh mà vẫn còn gây ức chế ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.
Âm tính (-) Dương tính (+)
Hình 2.3: Kết quả thí nghiệm HAI trên phiến.
2.2.3. Phương pháp đánh giá kết quả nghiên cứu
So sánh trước và sau tiêm vắc xin, nếu có sự tăng hiệu giá kháng thể cho thấy có đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin:
Xác định hiệu giá trung bình nhân (GMT) của huyết thanh chuột miễn dịch sau liều tiêm thứ nhất (sau 21 ngày) và sau liều tiêm thứ 2 (sau 35 ngày). Theo qui ước quốc tế đối với các mẫu huyết thanh âm tính đều được qui ước có hiệu giá kháng thể bằng 5 HAI.
Xác định tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh thông qua đánh giá động lực kháng thể giữa máu 1 và máu 2 so với máu nền (M1/M0 và M2/M0), giữa máu 2 và máu 1 (M2/M1). Theo qui định quốc tế về miễn dịch huyết thanh học, vắc xin tạo được đáp ứng miễn dịch khi động lực kháng thể tăng gấp ≥ 4 lần so với trước đó. So sánh đáp ứng miễn dịch (hiệu giá kháng thể trung bình nhân và động lực kháng thể) của chuột miễn dịch với vắc xin bảo quản trong 18 tháng và đáp ứng miễn dịch của vắc xin sau sản xuất 6 tháng ở nhiệt độ 5 ± 30C.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm IVACFLU- A/H5N1 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3
3.1.1. Hiệu giá kháng thể kháng HA (HAI) trung bình nhân
Bảng 3.1: Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân (GMT) sau liều tiêm thứ nhất
Liều miễn dịch Lô vắc xin
Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân (n = 16) 3 µg 1,5 µg 0,75 µg Lô 010215 30,84 25,93 16,81 Lô 040215 35,12 36,68 20,88 Trung bình 32,98 31,30 18,45 Lô 010215B 12,96 10,44 8,78 Lô 040215B 12,96 10,00 12,41 Trung bình 12,96 10,22 10,59
Sau liều tiêm thứ nhất đã có sự đáp ứng miễn dịch ở tất cả các độ pha (liều miễn dịch) mặc dù hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) không cao nhưng sự thay đổi về huyết thanh miễn dịch so với máu nền (tất cả đều âm tính hay bằng 5 HAI ở tất cả chuột được miễn dịch). Bảng 3.1 cho thấy ở liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột tạo được đáp ứng kháng thể trung bình nhân từ 8,7 HAI - 20,88 HAI.
Bảng 3.2: Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân (GMT) sau liều tiêm thứ hai
Liều miễn dịch Lô vắc xin
Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân (n = 16) 3 µg 1,5 µg 0,75 µg Lô 010215 207,49 153,22 113,14 Lô 040215 198,70 167,08 134,54 Trung bình 203,09 160,15 123,84 Lô 010215B 70,25 56,57 47,57 Lô 040215B 76,61 59,07 45,55 Trung bình 73,43 57,82 45,56
Sau liều tiêm thứ hai, hiệu giá kháng thể trung bình nhân ở tất cả các liều miễn dịch và ở tất cả các vắc xin nghiên cứu đề cho thấy tăng đáng kể so với sau liều thứ nhất. Kết quả cũng cho thấy ở các vắc xin hấp phụ tá chất đáp ứng kháng thể trung bình nhân hầu hết đều cao hơn so với vắc xin đối chứng không hấp phụ tương ứng ở các liều miễn
dịch 3 µg, 1,5 µg và 0,75 µg. Hiệu giá kháng trung bình nhân của các lô vắc xin hấp phụ cao hơn từ gấp 2 đến gấp 3 lần vắc xin không hấp phụ sau khi tiêm đủ 2 liều vắc xin.
Phân tích hiệu giá kháng thể trung bình nhân tương ứng với các liều miễn dịch sau liều tiêm thứ nhất và thứ 2 được chỉ ra ở các hình 3.1, 3.2 và 3.3.
Hình 3.1: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 3 µg HA/chuột.
Với liều miễn dịch 3 µg HA/chuột, hiệu giá kháng thể GMT đạt trung bình 203,09 HAI đối với vắc xin hấp phụ và đạt trung bình 73,43 HAI đối với vắc xin không hấp phụ (bảng 3.2). Như vậy có sự khác biệt về đáp ứng giữa vắc xin hấp phụ và vắc xin không hấp phụ sau cả 2 liều tiêm (M1 và M2). Vắc xin hấp phụ có hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân cao gấp 2,54 lần ở M1 và gấp 2,76 lần ở M2 so với vắc xin không hấp phụ. 0 50 100 150 200 0 10 20 30 40 Hiệu giá KT Thời gian
Hiệu giá kháng thể trung bình vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 3 µg/liều
hấp phụ
Hình 3.2: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 1,5 µg HA/chuột
Hình 3.2 cho thấy ở liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột, hiệu giá kháng thể GMT đạt trung bình 160,15 HAI đối với vắc xin hấp phụ và đạt 57,82 HAI đối với vắc xin không hấp phụ. Như vậy tương tự như với liều 3 µg HA/chuột có sự khác biệt về đáp ứng giữa vắc xin hấp phụ và vắc xin không hấp phụ. Ở liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột, vắc xin hấp phụ có hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân cao gấp 3,06 lần ở M1 và gấp 2,77 lần ở M2 so với vắc xin không hấp phụ.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 10 20 30 40 Hiệu giá KT Thời gian
Hiệu giá kháng thể trung bình vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 1,5 µg/liều
hấp phụ
Hình 3.3: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 0,75 µg HA/chuột.
Hiệu giá kháng thể trung bình nhân của liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột nhìn chung thấp hơn so với 2 liều miễn dịch 1,5 µg HA và 3 µg HA. Tuy nhiên giữa vắc xin hấp phụ và không hấp phụ vẫn có sự chênh lệch khá nhiều, vắc xin hấp phụ có hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân cao gấp 1,74 lần ở M1 và gấp 2,72 lần ở M2 so với vắc