3.3.1 Phân lập vi khuẩn
Bước 1: Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân.
- Dùng dụng cụ vô trùng gạt lấy đất vùng cạnh rễ và vùng xung quanh rễ (cách rễ 0 - 1cm) cho vào lọ chứa đã tiệt trùng, bảo quản lạnh (4-5oC) (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998).
- Cân 1g mẫu đất vùng rễ cho vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml nước cất vô trùng, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu. Đem các bình tam giác lên máy lắc khoảng 2 giờ.
- Sau khi lắc, tiến hành pha loãng mẫu 10, 100, 1000 lần, rồi nhỏ mỗi nồng độ pha loãng lên đĩa petri có chứa môi trường phân lập.
- Tiến hành phân lập song song trên hai môi trường NBRIP và Burk’s:
Dùng que gạt phân phối dịch mẫu trãi đều khắp dịch mặt thạch trên hai môi trường NBRIP và Burk.
Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh 2-3 ngày để vi khuẩn phát triển.
Bước 2: Làm thuần
- Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường đĩa nuôi cấy, cấy chuyển nhiều lần sang môi trường như trên đến khi các khuẩn lạc rời và đều so với các khuẩn lạc khác trên môi trường.
- Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn:
Từ một khuẩn lạc rời cấy vào một ống nghiệm chứa môi trương phân lập rồi ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh cho đến khi phát triển tốt.
Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn.
Nhỏ 30 µl nước cất vô trùng lên lam kính.
Khủ trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn trong ống nghiệm trải đều lên giọt nước trên lam kính.
Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với lam kính và giọt nước ép một góc 45o, hạ lamen xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí.
Quan sát kiểm tra độ ròng của mẫu.
- Nếu mẫu ròng thì cấy vào ống nghiệm chứa môi trường phân lập đễ trữ mẫu ròng.
Bước 3: chọn lọc dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân:
- Cấy chuyển những dòng vi khuẩn đã ròng khi phân lập trên môi trường NBRIP sang môi trường Burk’s (không đạm)
- Cấy chuyển những dòng vi khuẩn đã ròng khi phân lập trên môi trường Burk’s (không đạm) sang môi trường NBRIP
- Đĩa môi trưởng đã cấy mẫu được ủ trong tủ ủ vi sinh 2-3 ngày để vi khuẩn phát triển.
- Sau khi ủ 2-3 ngày tiến hành quan sát đánh giá những dòng vi khuẩn phát triển được trên 2 môi trường.
3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Hình dạng và chuyển động của vi khuẩn cũng được quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường.
Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng thước centimet (cm). Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
3.3.4 Xác định hàm lượng NH4+ do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp Indophenol Blue
Đây là phương pháp xác định hàm lượng NH4+ bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế (Spectrophotometer) tại bước sóng 636 nm (phương pháp so màu Indophenol Blue) theo nguyên tắc:
Ion hypochloride NaOH
NH4+ + Phenol Indophenol (màu xanh lá cây)
Chuẩn bị:
- Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào ống falcon 50-ml có chứa 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và tiến hành đo khả năng cố định đạm từng dòng vi khuẩn sau 2,4,6 và 8 ngày nuôi trên máy lắc 120 vòng/phút.
* Các bước tiến hành định lượng đạm tổng hợp:
Bước 1: Xây dựng đường chuẩn NH4+
Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 0 đến 5, lần lượt thêm vào mỗi ống các thành phần như bảng sau:
Bảng 3: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ . Ống nghiệm Thành phần 0 1 2 3 4 5 H2O (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 NH4+ chuẩn 1ppm (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1 Sodium Hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc nồng độ NH4+ càng cao thì màu xanh càng đậm dần.
Hình 3: Phản ứng tạo màu xanh molypdate của đường chuẩn
(ngày 22/10/2013)
0 1 2 3 4 5
Bước 2: Chuẩn bị mẫu đo: H2O (2 ml) + mẫu (0,5 ml) + Nitroprusside (1 ml) + Sodium Hypochloride (2 ml). Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút cho phản ứng màu tạo ra theo nguyên tắc nồng độ NH4+
càng cao thì màu xanh càng đậm dần.
Chú ý:
Để đo hàm lượng ammonium trong mẫu phải loại bỏ các tạp chất bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
Nếu hàm lượng ammonium trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường đạm chuẩn sẽ tiến hành pha loãng mẫu (5, 10, 50 lần) để hàm lượng ammonium đo được có giá trị chính xác.
Bước 3:
Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sóng 636 nm.
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đó tiến hành đo OD các mẫu chuẩn bị.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có NH4+ , không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại. Năm ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Từ giá trị OD tương ứng với hàm lượng đạm đã biết, dùng chương trình vẽ đồ thị trong phần mềm Excel xác định phương trình đường chuẩn NH4+ .
Bảng 4: Giá trị đường chuẩn NH4+.
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính hàm lượng NH4+ các mẫu còn lại: x = (y-b)/a.
Từ kết quả trên sẽ đánh giá sơ bộ về khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được và trên cơ sở đó chọn những dòng tạo hàm lượng NH4+ cao.
Hàm lượng NH4+ (x mg.l) 1 2 3 4 5
OD (y) y1 y2 y3 y4 y5
3.3.5. Xác định khả năng hòa tan lân của vi khuẩn
Đánh giá khả năng hòa tan lân theo phương pháp Blue – molypden.
Sau khi xác định dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân, dùng thuốc thử Acid Ascorbic – Ammoniummolypdate – Potassium antinomol tartrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn hòa tan trong dung dịch theo nguyên lý:
Lân sau khi được hòa tan trong môi trường tác dụng với ammoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolydate màu vàng.
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2H+ (NH4)3[P(MoO10)4] Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880nm.
Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ P nhỏ ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ thuận với hàm lượng P theo đúng đinh luật Bir Lambeg.
* Để đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn, tiến hành thí nghiệm sau:
-Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trường NBRIP lỏng thu sinh khối: chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào ống falcon 50-ml có chứa 20 ml môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999), lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007).
-Lấy mẫu vào thời điểm 5, 10 và 15 ngày nuôi. Lọc lấy 2 ml phần dịch trong để xác định hàm lượng lân hòa tan theo phương pháp Blue – molypden.
* Các bước tiến hành xác định lượng lân hòa tan
Bước 1: Dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm (loại 20 ml), đánh số thứ tự từ 0 đến 5 tương ứng với hàm lượng P2O5 trong ống, lần lượt thêm vào mỗi ống nghiệm các thành phần như sau:
Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 . Ốngnghiệm
Thành phần (ml) 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng 5 5 5 5 5 5
Dung dịch lân chuẩn 10ppm 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch B 4 4 4 4 4 4
Nước khử khoáng 3,5 3 2,5 2 1,5 1
Tiến hành trộn mẫu trên máy vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc hàm lượng P2O5 càng cao thì màu xanh càng đậm dần.
Bước 2: chuẩn bị mẫu: mẫu được lọc qua giấy lọc trước khi đo lân, cho vào mỗi ống nghiệm các thành phần sau: 5 ml nước khử khoáng, 0,5 ml dung dịch mẫu. Thêm 4 ml dung dịch B, 3 ml nước khử khoáng.
Trộn đều dung dịch trong máy vortex, để ổn định 20 phút tại nhiệt độ phòng.
Bước 3: Tiến hành đo hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu dựa trên phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đường chuẩn, sau đó mới tiến hành đo OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 ( không có P2O5, không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại.
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: y = a*x + b.
Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/l) y là độ hấp thu quang (OD880nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng P2O5.
3.3.6 Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NBRIP và Burk’s lỏng trong các ống nghiệm.
Hút 100 µl mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 2 ml môi trường NBRIP và
Burk’s có và không có bổ sung tryptophan trong các effendof (2 ml), để trong bóng tối,
nuôi trong 8 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
Lấy mẫu vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA vi khuẩn tổng hợp được bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm. IAA được tạo ra trong dung dịch sẽ phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu hồng xậm tùy thuộc vào IAA do vi khuẩn tạo ra.
Chuẩn bị thuốc thử Salkowsky
Đong 533 ml H2SO4 đậm đặc vào bình đựng chuẩn, thêm từ từ nước cất vào đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc.
Cân 4,5 gam FeCl3 cho vào cốc, thêm từ từ dung dịch H2SO4 đậm đặc 10.8 M vào cốc và khoấy cho FeCl3 tan đều, để nguội. Bảo quản trong chai xậm màu.
Tiến hành dựng đường chuẩn đo IAA
Bảng 6: Đường chuẩn đo IAA.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4
Nước khử khoáng 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Thuốc thử 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
IAA chuẩn 0µl 2µl 4µl 6µl 8µl
Đo mẫu
Lấy mẫu ở các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày sau khi nuôi, ly tâm 12000 vòng/phút/5 phút.
Sau khi ly tâm hút 0,5 ml lấy dịch vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa 0,5 ml H2O khử khoáng và 1 ml thuốc thử Salkowki để ổn định khoảng 15 phút trong tối, tiến hành đo OD bước sống 530 nm.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn vùng rễ đã phân lập được được
4.1.1 Nguồn gốc và kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ
Từ 8 mẩu đất vùng rễ ở tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu và ở tỉnh Bình Dương đã phân lập được 49 dòng vi khuẩn. Trong số 49 dòng vi khuẩn đã phân lập, số dòng được phân lập từ mẫu rễ ở tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu là 29 dòng (trong đó 22 dòng trên môi trường NBRIP và 17 dòng trên môi trường Burk’s) và ở Bình Dương phân lập được 10 dòng (trong đó có 5 dòng trên môi trường NBRIP và 5 dòng trên môi trường Burk’s).
Bảng 7: Nguồn gốc của 22 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Burk’s.
Số TT Nơi thu mẩu Số mẩu Số dòng vi khuẩn phân lập được
1 Bình Dương 1 5 dòng vi khuẩn
2 Bà Rịa-Vũng Tàu 7 17 dòng vi khuẩn
Bảng 8: Nguồn gốc của 27 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NBRIP.
Số TT Nơi thu mẩu Số mẩu Số dòng vi khuẩn phân lập được
1 Bình Dương 1 5 dòng vi khuẩn
4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập Bảng 9: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập. Bảng 9: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập.
Số TT
Dòng vi khuẩn
Đặc điểm vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Chuyển động Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi ĐK (mm)
1 VDN1a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,5
2 VDN1b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2
3 VDN1c Que ngắn + Vàng đục Tròn đều Nguyên Mô 0.5
4 VDN2a Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1
5 VDN2b Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 1.5
6 VDN3a Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 2
7 VDN3b Que ngắn + Vàng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,5
8 VDN3c Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 0,5
9 VDN3d Que ngắn + Vàng cam Tròn đều Nguyên Mô 0,5
10 VDN4a Que ngắn + Vàng đục Tròn đều Nguyên Mô 2
11 VDN4b Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 1
12 VDN5a Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1
13 VDN5b Que ngắn + Vàng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
14 VDN5c Que ngắn + Vàng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
15 VDN6a Que ngắn + Vàng đục Không đều Răng cưa Lài 0,5
16 VDN6b Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 2
17 VDN6c Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 0,5
18 VDN7a Que ngắn + Vàng trong Không đều Răng cưa Mô 0,5
19 VDN7b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,5
20 VDN7c Que ngắn + Vàng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,5
21 VDN7d Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1,5
22 VDN7e Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 2
23 BDN1 Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 0,5
24 BDN2 Que ngắn + Vàng trong Không đều Răng cưa Mô 0,5
25 BDN3 Que ngắn + Vàng trong Tròn đều Nguyên Mô 1,5
26 BDN4 Que ngắn + Vàng trong Không đều Răng cưa Lài 1
27 BDN5 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 2
28 VDB1a Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1
29 VDB1b Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 0,5
30 VDB2a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
31 VDB3a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
32 VDB3b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,5
33 VDB3c Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
34 VDB3d Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
35 VDB4 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
37 VDB5b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
38 VDB6a Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 0,5
39 VDB6b Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1,5
40 VDB7a Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 0,5
41 VDB7b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
42 VDB7c Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
43 VDB7d Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
44 VDB7e Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
45 BDB1 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1
46 BDB2 Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5
47 BDB3 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1