Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng GD3
Khi so sánh các trình tự gen 16S rDNA của chủng GD3 với các trình tự gen tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen 16S rDNA của chủng GD3 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng của chi Bacillus (bảng 3.5, hình 3.8). Như vậy, kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng vi khuẩn GD3 thuộc chi Bacillus và đặt tên là Bacillus sp. GD3.
Bảng 3.5. Kết quả so sánh trình tự gen 16S rDNA của chủng Bacillus sp. GD3 với gen tương ứng của các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus được đăng ký trên GenBank
Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn được so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tương đồng (%) Bacillus sp. CL33 II.1.1 FJ688409 99 Bacillus sp. DB149 HM566862 99 Bacillus sp. DB142 HM566856 99 Bacillus sp. DB157 HM566870 99 Bacillus sp. DB189 HM566899 99
35
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng laoij của chủng GD3 với các chủng vi khuẩn thuộc chi
Bacillus khác. Giá trị bootstrap thể hiện như là tỷ lệ phần trăm.
Nhằm phân loại chủng GD3 đến loài để đánh giá độ an toàn của chủng trong chế phẩm, bên cạnh kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA, đặc điểm sinh hóa của chủng đã được xác định bằng bộ kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp). Kết quả được trình bày ở hình 3.9 và hình 3.10.
Hình 3.9. Các đặc điểm sinh hóa của chủng GD3 sau 48 giờ (kit API 50CHB) GD3
36
Hình 3.10. So sánh đặc điểm sinh hóa của chủng GD3 với sơ sở dữ liệu bằng phần mềm APILAB plus
Như vậy, từ kết quả so sánh đặc điểm sinh hóa của chủng GD3 với sơ sở dữ liệu bằng phần mềm APILAB plus; đặc điểm hình thái khóa phân loại vi sinh vật Bergey’s; kết hợp phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, chủng GD3 có đặc điểm tương đồng với loài Bacillus amiloliquefaciens.
Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng 1GD1 và 1GD2
Khi so sánh các trình tự gen 16S rDNA của chủng 1GD1 và 1GD2 với các trình tự gen tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen 16S rDNA của các chủng 1GD1 và 1GD2 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng của loài Pediococcus pentosaceus (hình 3.11); Pediococcus acidilactici (hình 3.12).
37
Hình 3.11 Cây phat sinh chủng loại Pediococcus pentosaceus 1GD1 với các chủng vi khuẩn thuộc chi Pediococcus khác. Giá trị bootstrap thể hiện như là tỷ lệ phần trăm.
1GD1
38
Hình 3.12. Cây phat sinh chủng loại Pediococcus acidilactici 1GD2 với các chủng vi khuẩn thuộc chi Pediococcus khác. Giá trị bootstrap thể hiện như là tỷ lệ phần trăm.
Từ các kết nghiên cứu đặc điểm sinh học; kết hợp phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, hai chủng 1GD1 và 1GD2 có độ tương đồng cao lần lượt với các loài:
Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici
Hai chủng 1GD1 và 1GD2 thuộc lớp Bacilli, bộ Lactobacillales, họ
Lactobacillaceae, chi Pediococcus. Chủng GD3 thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ
Bacillaceae, chi Bacillus, loài amyloliquefaciens. Theo thông báo của GRSA (Generally Recognized as Safe), loài Pediococcus pentosaceus; Pediococcus acidilactici và loài Bacillus amyloliquefaciens thuộc vi sinh vật an toàn cấp độ 1. Chi
Pediococcus có tính cạnh tranh, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh mạnh, ví dụ: sử dụng nhóm Lactobacillaceae ở nồng độ 106 ÷ 108 có thể ức chế được E. coli, Salmonella. Đồng thời, chi Pediococcus thuộc nhóm vi khuẩn lactic acid (LAB) đã được FDA (U.S. Food and Drug Administration) xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn, và là vi sinh vật có thể được sử dụng trong chăn nuôi, các sản phẩm probiotic trong chế độ ăn uống.
Bảng 3.6. Bảng tổng hợp kết quả phân tích số lượng và thành phần vi sinh vật trong chế phẩm Bio-PB
STT Các chỉ tiêu phân tích Đơn vị KQ phân tích
1 Pediococcus acidilactici CFU/g 5,3.106
2 Pediococcus pentosaceus CFU / g 5,3.106
3 Bacillus amyloliquefaciens CFU/g 1,9.106
4 Đạm thô % 4,60
5 Độ ẩm % 13,4
6 Chất béo thô % 0,89
7 Chất xơ thô % 19,81
8 Tro % 15,93
9 Tổng cacbon % 32,13
10 Tổng Nitơ % 3,07
11 Tổng P % 17,5
39 12 Asen mg/kg 1,30 13 Cu mg/kg 28,09 14 Co mg/kg 0,94 15 Hg mg/kg KPH 16 Pb mg/kg 1,77 17 E. coli CFU/g KPH 18 Salmonella CFU/2 g KPH
Kết luận: Trong thành phần chế phẩm Bio – PB không chứa vi sinh vật và các thành phần gây huy hại cho người và động vật.
