sẽ có màu xanh tím. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod được giải thích do sự hấp thụ iod vào phía trong các vòng xoắn ốc của tinh bột, mỗi vòng xoắn ứng với 6 đơn vị glucose thì có 1 phân tử iod. Những phân tử chưa đủ 6 đơn vị glucose thì sẽ không phản ứng với iod. Mặt khác α-amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột bằng cách cắt ngẫu nhiên vào liên kết (1-4) và sản phẩm thu được chủ yếu là maltose, glucose và dextrin phân tử nhỏ. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế α-amylase càng mạnh thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân càng ít. Như vậy, bằng cách đo độ hấp phụ iod của phân tử tinh bột tại bước sóng 565nm sau phản ứng sẽ phản ánh được hàm lượng tinh bột còn lại trong mẫu cũng như hoạt tính ức chế α-amylase của mẫu thử (có chất ức chế α- amylase) khi so sánh với mẫu chuẩn (không có chất ức chế α-amylase).
+ Tiến hành: Hoạt tính ức chế α-amylase của dịch chiết được khảo sát dựa vào phương pháp tạo màu của Ali và cộng sự [25].
Hỗn hợp phản ứng gồm: 1 ml tinh bột 1% (kl/tt) và 1 ml enzym α-amylase (1,5 đơn vị/ml) trong đệm acetat (0,1 M, pH 7,2), 1 ml dung dịch mẫu thử (cao dược liệu/ acarbose), 2 ml đệm acetat. Ủ hỗn hợp 25 phút ở 37P
0
P
C. Kết thúc phản ứng bằng cách thêm 1ml dung dịch HCl, lắc/trộn đều. Sau đó, thêm 0,1 ml dung dịch chỉ thị màu iod. Đo OD ở bước sóng 565 nm.
Mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-amylase) và mẫu chuẩn (có α-amylase, không có mẫu thử) tiến hành song song. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình và xác định hoạt tính ức chế α-amylase theo công thức :
% ức chế = (ODRmẫuRRthử R- ODRmẫuRRchuẩnR)/ ODRmẫuRRthử Rx 100 % Xác định giá trị ICR
50R (nồng độ của mẫu thử ức chế 50% hoạt tính enzym α- amylase) dựa vào phương trình tuyến tính giữa % ức chế và nồng độ mẫu thử. Hoạt tính ức chế của mẫu thử càng mạnh thì giá trị ICR
50R càng thấp.
- Khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase in vitro
+ Nguyên tắc: Để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α -glucosidase, dùng p- nitrophenyl α-D-glucopyranosid (pNPG) làm chất nền. Chất nền sẽ bị enzym α - glucosidase chuyển hóa thành α -D-glucose và p-nitrophenol (pNP) theo phản ứng sau:
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với lượng p-nitrophenol. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế α-glucosidase thì hàm lượng p-nitrophenol cũng như lượng glucose tạo thành sẽ giảm. Lượng p-nitrophenol sinh ra được xác định bằng cách đo độ hấp thu tại bước sóng 405 nm sẽ phản ánh hoạt tính ức chế α-glucosidase của mẫu thử (có chất ức chế α-glucosidase) so sánh với mẫu chuẩn (không có chất ức chế α-glucosidase).
+ Tiến hành:Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao được khảo sát bằng phương pháp tạo màu của Ranilla và cộng sự (2010) có hiệu chỉnh trên đĩa elisa 96 giếng [39].
Hỗn hợp gồm 20 µl α -glucosidase (0,5 unit/ml), 120 µl đệm phosphat 0,1M (pH 6,9), 10 µl mẫu thử (cao dược liệu/ acarbose) ở các nồng độ khác nhau. Hỗn hợp được ủ ở 37°C trong 15 phút. Thêm 20 µl dung dịch p-nitrophenyl- α -D-glucopyranosid 5mM trong đệm phosphat 0,1M. Lắc/trộn đều, ủ ở 37°C trong 15 phút. Kết thúc phản ứng bằng cách thêm 80 µl dung dịch natri carbonat 0,2M (pH 9,6), lắc/trộn đều. Đo độ hấp thu OD ở bước sóng 405 nm.
Mẫu trắng (mẫu thử, không có α - glucosidase) và mẫu chuẩn (α - glucosidase, không có mẫu thử) được tiến hành song song. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình và xác định % ức chế α -glucosidase theo công thức:
% ức chế = (ODRmẫuRRchuẩn R- ODRmẫuRRthửR)/ ODRmẫuRRchuẩn Rx 100 % Xác định giá trị ICR
50 R(nồng độ của mẫu thử ức chế 50% hoạt tính enzym α- glucosidase) dựa vào phương trình tuyến tính giữa % ức chế và nồng độ mẫu thử. Hoạt tính ức chế của mẫu thử càng mạnh thì giá trị ICR50Rcàng thấp.
2.2.4. Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê
Kết quả được xử lý bằng Microsoft Excel, trình bày dưới dạng giá trị trung bình của 3 lần đối với thí nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế α-amylase và hoạt tính ức chế α-glucosidase in vitro.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC
3.1.1. Cây Mướp đắng rừng
Tên khoa học: Momordica charantia L. var. abbreviata Ser. [2] Tên gọi khác: Khổ qua rừng [2]
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái
Thân: Dây leo bằng tua cuốn. Tua cuốn không phân nhánh, dạng sợi mảnh, dai, màu xanh lục nhạt, phủ nhiều lông trắng mịn, mọc ở nách lá. Thân non màu xanh lục nhạt, có tiết diện đa giác, phủ đầy lông trắng mịn, thân già có màu xanh lục đậm. Lá:
đơn, mọc so le, không có lá kèm. Phiến lá có lông nhám và có thùy dạng chân vịt, thùy hình bầu dục, đầu thùy nhọn hoặc hơi tù, mép có răng cưa cạn đầu nhọn, thùy giữa kích thước 3-4 x 2,5-3 cm, các thùy bên kích thước 2,5-3,5 x 2-2,5 cm. Phiến lá màu xanh lục ở đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới. Gân lá hình chân vịt với 5 gân chính nổi rõ ở mặt dưới, các gân phụ tạo thành hình mạng. Trên gân chính phủ đầy lông dài trắng mịn, gân mặt dưới nhiều lông hơn gân mặt trên. Cuống lá màu xanh lục nhạt, mặt trên lõm có hai mép màu xanh lục đậm, mặt dưới lồi và có nhiều lông hơn mặt trên, dài 2,5-3 cm. Hệ thống ở nách lá gồm các cơ quan: 1 chồi, 1 tua cuốn, 1-2 hoa đực hoặc 1-2 hoa cái. Hoa: mọc riêng lẻ ở nách lá, đơn tính cùng gốc, đều, mẫu 5.
Hoa đực: cuống hoa màu xanh lục nhạt, dài 6-8 cm, phủ đầy lông trắng mịn. Lá bắc cách gốc cuống hoa 2-3 cm, không cuống, hình thận, màu lục đậm mặt trên, nhạt mặt dưới, kích thước 0,7-0,9 x 0,5-0,7 cm, gân lá hình chân vịt với 5 gân chính, gân giữa nổi rõ ở mặt dưới, các gân phụ tạo thành hình mạng, hai mặt đều phủ lông trắng. Lá đài 5, đều, ống đài hình chuông, màu xanh nhạt, cao 0,2-0,3 cm, trên chia 5 phiến hình bầu dục nhọn ở đầu, màu vàng nhạt, dài 0,3-0,5 cm, 2 mặt có gân dọc và nhiều lông trắng ngắn. Tiền khai đài 5 điểm. Cánh hoa 5, đều, rời nhưng dính với ống đài, phía dưới thuôn, phía trên loe rộng, cánh hoa hơi nhăn, màu vàng, kích thước 0,6-0,8 cm x 1,2-1,4 cm, có 6-7 gân chính màu xanh nhạt tỏa ra từ đáy và nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ tạo thành hình mạng, 2 mặt cánh hoa có lông tơ trắng, ngắn. Tiền khai cánh hoa 5 điểm. Nhị 3, đều, chụm lại ở giữa hoa và dính nhau ở bao phấn, chỉ nhị rời, màu trắng, dài khoảng 0,1-0,2 cm, 2 nhị mang bao phấn 2 ô, 1 nhị mang bao phấn 1 ô. Bao phấn
dạng khúc khuỷu, màu vàng, cao khoảng 0,25 cm, nứt dọc, đính đáy. Hạt phấn rời, màu vàng cam, hình bầu dục, có rãnh. Hoa cái: cuống hoa giống cuống hoa đực nhưng ngắn hơn. Lá bắc giống lá bắc hoa đực, cách gốc cuống hoa 1-2 cm. Lá đài 5, đều, hình bầu dục khum nhọn ở đỉnh, dính nhau một đoạn 0,1 cm tạo thành hình đĩa, phía trên chia thành 5 phiến, màu xanh lục nhạt. Tiền khai đài 5 điểm. Cánh hoa giống cánh hoa đực nhưng nhỏ hơn, dễ rụng. Nhụy có 3 lá noãn, bầu dưới 3 ô, mỗi ô mang nhiều noãn. Bầu noãn hình bầu dục thuôn ở hai đầu, bề mặt gồ ghề, phần gồ lên nhọn, phủ nhiều lông, dài 1-1,2 cm, đường kính 0,2-0,4 cm. 1 vòi nhụy hình trụ màu xanh nhạt cao 0,3-0,5 cm, 3 đầu nhụy màu vàng, mỗi đầu nhụy chia thành 2 thùy dạng chữ V.
Quả: thịt, hình bầu dục thuôn hẹp hai đầu, khi non màu xanh lục khi chín màu vàng cam, bề mặt gồ ghề, kích thước 2,5-3,0 x 1,5-1,7 cm. Hạt: nhiều, màu trắng, hình bầu dục dẹt, một đầu nhọn, khi chín nhớt, có màng đỏ bao quanh. (Hình 3.1.)
3.1.1.2. Đặc điểm giải phẫu
Rễ
Vi phẫu rễ tròn. Bần 2-3 lớp tế bào hình chữ nhật, vách tẩm bần mỏng có thể bong tróc. Nhu bì, 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật. Mô mềm đạo, 2-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn, rải rác có những cụm mô cứng, ở rễ càng già các cụm mô cứng xuất hiện nhiều hơn. Hệ thống dẫn không liên tục thường có 3-5 vùng libe-gỗ. Libe 1 khó nhận diện, libe 2 có tế bào hình chữ nhật, xếp xuyên tâm, trong vùng libe có nhiều mạch rây to, rõ. Gỗ 2 chiếm tâm và không liên tục, các tia tủy rộng; mạch gỗ gần tròn, kích thước to, nhiều, xếp lộn xộn; mô mềm gỗ 2 có các tế bào hình đa giác vách tẩm chất gỗ. Tia tủy rộng, 4-8 dãy tế bào hình bầu dục hẹp, dài, vách cellulose. (Hình 3.2.)
Thân
Vi phẫu thân non hình ngũ giác với 5 góc lồi và 5 cạnh lõm. Biểu bì tế bào hình chữ nhật hay hơi đa giác, rải rác có lỗ khí đôi khi nhô cao hơn so với tế bào biểu bì. Nhiều lông che chở đa bào 1 dãy rất dài (8-10 tế bào). Ít lông tiết, có 2 dạng: dạng chân đơn bào, đầu 4 tế bào và dạng chân đa bào (2 tế bào), đầu đa bào hình bầu dục (4 tế bào). Mô dày góc chỉ có ở góc vi phẫu, 5-7 lớp tế bào hình bầu dục, gần tròn hay hơi đa giác, kích thước không đều nhau, xếp lộn xộn. Mô mềm đạo, 3-5 lớp tế bào
hình bầu dục, kích thước không đều nhau, xếp lộn xộn. Vòng mô cứng là lớp tế bào hình đa giác gián đoạn ở thân già và liên tục quanh thân non, dày ở góc vi phẫu (4-6 lớp tế bào), mỏng ở các cạnh (3-4 lớp tế bào), 2-3 lớp tế bào bên trong kích thước lớn hơn các lớp bên ngoài. Hệ thống dẫn gồm 2 vòng bó libe-gỗ kiểu chồng kép, vòng ngoài gồm 5 bó nhỏ ở các góc, vòng trong có 5 bó lớn ở các cạnh. Mỗi bó dẫn gồm có: libe 1 hình dạng méo mó do bị libe 2 ép dẹp. Libe 2, mạch rây to và rõ, các tế bào mô mềm khá đều, xếp xuyên tâm. Mạch gỗ 2 tiết diện gần tròn, mô mềm gỗ 2 có tế bào hình đa giác vách tẩm chất gỗ. Gỗ 1 rõ, 9-10 bó, mô mềm gỗ 1 có tế bào hình đa giác vách cellulose. Cụm libe trong, vài lớp tế bào trong cùng bị ép dẹp. Mô mềm tủy đạo, hẹp, tế bào hình bầu dục hay đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn. (Hình 3.3.)
Lá
Gân giữa: Lồi ở cả 2 mặt, mặt trên tạo thành chóp. Biểu bì tế bào hình chữ nhật, lớp cutin ở biểu bì dưới có răng cưa, dày hơn biểu bì trên. Lông che chở đa bào giống ở thân, nhiều hơn ở biểu bì trên. Lông tiết ít, thường gặp ở biểu bì trên. Mô dày góc trên (4-5 lớp tế bào), mô dày dưới (2-3 lớp tế bào), tế bào gần tròn hay bầu dục, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Mô mềm đạo, tế bào gần tròn hay hơi đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Tiếp giáp với hệ thống dẫn libe-gỗ là cụm tế bào đa giác nhỏ vách cellulose xếp khít nhau. Hệ thống dẫn cấu tạo cấp 1; gồm 3 bó, bó giữa to nhất, xếp thành vòng cung không liên tục với libe ở dưới và gỗ ở trên; các lớp libe tế bào hình đa giác, nhỏ, vách uốn lượn, xếp lộn xộn; mạch gỗ hình bầu dục hay đa giác xếp thành dãy hay lộn xộn; mô mềm gỗ vách cellulose hay tẩm chất gỗ; phía trên gỗ là cụm libe trong.
Phiến lá: Tế bào biểu bì có hình dạng như ở phần gân giữa, biểu bì trên kích thước to hơn biểu bì dưới, lớp cutin phẳng. Ở biểu bì dưới rải rác có 1 hay 2 tế bào phình to xếp cạnh nhau chứa khối tinh thể có hình dạng đặc biệt. Lỗ khí rải rác ở biểu bì dưới. Trên 2 lớp biểu bì có ít lông che chở và lông tiết có cấu tạo như ở gân giữa. Mô mềm giậu, 1lớp tế bào, hình chữ nhật thuôn và dài. Mô mềm khuyết, tế bào hình đa giác, bầu dục hay gần tròn, sắp xếp chừa những khuyết nhỏ. Các bó dẫn phụ với gỗ ở trên, libe ở dưới. (Hình 3.4.)
Cuống lá
Vi phẫu cuống lá có mặt trên lõm, mặt dưới lồi, 2 bên có 2 cánh nhỏ. Tế bào biểu bì có hình dạng giống ở gân lá, biểu bì ở mặt dưới vi phẫu cuống lá có lớp cutin răng cưa. Rải rác có lỗ khí, lông che chở và lông tiết giống ở thân. Mô dày góc thường có ở các góc lồi và ở phía trên các bó libe gỗ, 3-5 lớp tế bào hình đa giác hay gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Mô mềm đạo, tế bào gần tròn hay bầu dục kích thước không đều, xếp lộn xộn. Hệ thống dẫn cấu tạo cấp 1 gồm 8 bó libe gỗ xếp trên một vòng, bó giữa phía biểu bì dưới to hơn, bó giữa ở phía biểu bì trên nhỏ nhất. Cấu tạo của các bó libe gỗ giống phần gân giữa vi phẫu lá. Ngay bên ngoài libe là 3-5 lớp tế bào mô mềm hình đa giác xếp xít nhau, vách hơi uốn lượn, kích thước to hơn tế bào libe, vách cellulose hoặc tẩm chất gỗ. (Hình 3.4.)
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.
A. Cây Mướp đắng, B. Hệ thống nách lá, C. Lá, D. Hoa (1. Hoa đực nhìn thẳng, 2. mở dọc, 3. Hoa cái nhìn thẳng, 4. mở dọc), E. Nhị, F. Hạt phấn, G. Nhuỵ, H. Bầu nhụy (1. cắt dọc, 2. cắt ngang), I. Quả
Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu rễ Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.
A. Vi phẫu thân non, B. Vi phẫu thân già C. Một phần vi phẫu (1. Thân non, 2. Thân già)
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.
3.1.2. Cây Tầm bóp
Tên khoa học: Physalis angulata L. [4]
Tên gọi khác: Thù lù, Toan tương, Lu lu cái [2], [4]
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Thân: Cỏ sống hàng năm, cao 50 – 80 cm, phân cành nhiều tỏa rộng ra, có góc cạnh, rỗng ở giữa, nhiều lông ngắn và gân dọc màu tím. Lá: Đơn, mọc cách, đoạn mang hoa có lá mọc thành đôi, không đều, lá to dài 5-7 cm và rộng 3-4 cm, lá nhỏ dài 2,5-3 cm và rộng 1,5- 2 cm. Phiến lá hình trứng hay bầu dục, đầu nhọn; gốc hình nêm, không đối xứng, lệch nhau khoảng 0,5 cm; màu xanh lục, mặt trên sậm hơn mặt dưới, có nhiều lông, mép lá có răng cưa thưa, không đều. Gân lá hình lông chim nổi rõ ở mặt dưới, gân bên 5 -7 đôi. Cuống lá dài 1-3 cm, màu xanh, có nhiều lông. Hoa: Mọc cô độc ở nách lá, lưỡng tính, màu vàng lợt, đường kính 0,8-1 cm, cuống hoa màu tím dài 0,5 cm, phủ đầy lông, đỉnh uốn cong xuống phía dưới. Bao hoa: 5, lá đài màu xanh có gân tím nổi rõ, dài 0,4 cm, dính nhau thành hình chuông, ống đài cao 0,2 cm, thùy hình tam giác, dài gần bằng ống đài, có lông mặt ngoài, có đốm nâu mặt trong. 5 cánh hoa, dài 0,6-0,8 cm, có 3 gân dọc nổi rõ, dính nhau phía dưới thành tràng hình phễu, ống tràng cao 0,4 cm, có đốm hình chữ nhật màu vàng nâu, rất nhiều lông dài ở đầu phần ống hẹp và giữa mặt trong, tận cùng chia năm thùy cạn đều nhau. Nhị 5, rời, ba nhị dài, hai nhị ngắn, chỉ nhị hình sợi màu trắng xanh, đính trên ống tràng xen kẽ với cánh hoa, bao phấn hình bầu dục 2 ô, đính đáy, hạt phấn rời, màu vàng nhạt, hình bầu dục, có rãnh dọc ở giữa. Nhụy có 2 lá noãn, dính nhau thành bầu trên 2 ô, mỗi ô nhiều noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy 1, hình sợi, màu trắng xanh; đầu nhụy 1, hình cầu,
