2.2.2.I. Chuẩn bị chế phẩm thử
> Chuẩn bi các dỉch thử
Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của XHLH dưói dạng dịch sắc, dịch ép dược liệu tưcd và dịch chiết trong các dung môi cồn, Ethyl acetat bao gồm:
- Dịch ép cây tưoi XHLH (DE) được điều chế bằng cách nghiền trong cối sứ cho đến khi thu được khối nhão rồi đem lọc lấy nước để thử.
- Dịch sắc dược liệu khô 1:1 ký hiệu là SK (1:1) - Dịch sắc dược liệu khô 5:1 ký hiệu là SK (5:1) - Dịch sắc dược liệu tưoi 5:1 ký hiệu là ST (5:1)
Các dịch sắc được điều chế theo phương pháp cổ truyền và được cô thành các dạng cao l:lv à cao 5:1: cân 200g dược liệu cho vào nồi, đun sôi nhỏ lửa trong Ih sau đó gạn lấy dịch sắc, tiến hành sắc 3 lần gộp các dịch sắc lại cô thành cao 1:1 và cao 5:1.
- Dịch chiết dược liệu khô trong cồn 1:1 ký hiệu là c (1:1). - Dịch chiết dược liệu khô trong cồn 5:1 ký hiệu là c (5:1).
- Dịch chiết dược liệu khô trong Ethyl acetat 5:1 ký hiệu là E (5:1).
Các dịch chiết dược điều chế bằng phương pháp ngâm nhỏ giọt trong bình ngấm kiệt và cô thành các dạng cao 1:1 và cao 5:1.
+ Dịch chiết Ethanol: dược liệu được tán dưói dạng bột thô, cân lấy 200g thấm ẩm bằng Ethanol tuyệt đối trộn đều để yên trong 2h. Sau đó chuyển vào bình ngấm kiệt đã chuẩn bị sẵn, mở khoá bình rót Ethanol 70°c từ từ vào bình đến khi có 1-2 giọt chảy ra, khoá bình. Thêm Ethanol 70®c đến ngập dược liệu, để yên 24h ở nhiệt độ phòng.
Rút dịch chiết: tốc độ 18-20 giọt/ phút, đồng thời bổ sung thêm dung môi đến khi được khoảng 800ml dịch chiết thì không bổ sung dung môi nữa. Mở khoá bình cho dịch chảy trực tiếp xuống.
Cất thu hồi dung môi dưói áp suất giảm đến thể tích nhất định, sau đó cô để được dịch chiết 1:1, làm tưofng tự để được dịch chiết 5:1.
+ Dịch chiết Ethyl acetat được tiến hành tương tự như dịch chiết cồn nhưng bỏ qua giai đoạn thấm ẩm, được dịch chiết Ethyl acetat 5:1.
> Chuẩn bi chất chuẩn
- Kháng sinh chuẩn: đối vói G(+) sử dụng dung dịch Benzathin Penicilin G: 28,8 lU/ml, đối vói G(-) sử dụng dung dịch Gentamicin: 20 |Jg gentamicin base/ml.
2.22.2. Chuẩn bị giống vi sinh vật
Giống vsv kiểm định do bộ môn Vi sinh- sinh học Trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp:
5 chủng vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922 (EC)
Proteus mirabilis BV 108 (Pro)
Shigella flexneri DT 112 (Shi)
Salmonella typhi DT220 (Sal)
+ 5 chủng vi khuẩn Gram(+):
Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)
Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)
Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs)
Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
Sarcina lutea ATCC 9341 (SL)
Dùng môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định. Công thức:
Cao thịt 0,3%- Pepton 0,5%. NaCl 0,5%.
Nước vừa đủ lOOml.
Pha lOOml môi trường, lấy 10 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống 5 ml môi trường. Đem hấp tiệt trùng ở 117-118°c trong 30 phút. Sau đó lấy ra, để nguội, cấy các chủng VK kiểm định vào, mỗi chủng vi khuẩn cấy vào 1 ống môi trường (tiến hành trong tủ cấy vô trùng), sau khi cấy xong nuôi vi khuẩn trong tủ ấm ở 37°c, thcd gian nuôi từ 18-24h đến nồng độ 10^ tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn).
2.2.2.3. Chuẩn bị khoanh giấy thử
- Đục khoanh giấy lọc có đường kứủi D = 6-6,5 mm khối lượng 33,5-34,0 mg. - Hấp tiệt trùng các khoanh giấy ở nhiệt độ 121® c trong thòi gian 30 phút, sau đó sấy ở 60°c trong 5-lOh.
- Cho các khoanh giấy đã tiệt trùng vào 5 đĩa petri sạch mỗi đĩa tẩm một trong các mẫu thử. Sau mỗi lần tẩm, đem sấy ở nhiệt độ 50°c đến khô, tẩm 3 lần.
2.2.2A. Chuẩn bị môi trường thử kháng khuẩn
Môi trường thạch thường có công thức: NaCl 0,5%.
Cao thịt 0,3%- Thạch 1,6%.
Nước vừa đủ lOOml.
Pha 1000 ml môi trường, chia vào 10 bình nón dung tích 250 ml mỗi bình 100 ml, đem hấp tiệt trùng ở 121®c trong 30 phút. Để nguội đến 45-50°C rồi lần lượt cho mỗi vi khuẩn kiểm định đã nuôi cấy vào mỗi bình nón nói trên vớitỷlệ2,5m l/100m L
2.2.2.5. Tiến hành
Trên các hộp petri vô trùng có đường kính như nhau. Cho vào mỗi hộp petri 20 ml môi trường thạch thường có trộn VK kiểm định vói thể tích 20 ml/đĩa cho thạch đông lại.
Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên môi trường thạch thường có chứa vsv kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°c
trong 18-24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có bằng thước kẹp Panmer (độ chính xác 0,02 mm).
Đánh giá kết quả: dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:
_ _ p > ^ ị i p i - D )
n \ n - \
D: là đường kính trung bình vòng vô khuẩn Dịi đưcmg kúứi vòng vô khuẩn
s : độ lệch thực nghịêm chuẩn có hiệu chỉnh n: số thí nghiệm làm song song
2.2.2.Ó. Kết quả
Các kết quả thu được sau khi đem xử lý hiệu chỉnh có chọn lọc được giới thiệu theo bảng và hình sau: (Bảng 1), (Hình 9)
Bảng 1: Đường kính vòng vô khuẩn của chế phẩm thử XHLH
s r r
Đường kmh vòng vô khuẩn (mm) Độ lệch thực nghiệm có hiệu chỉnh
Bc Bp Bs SL Sta EC Pro Pseu Sal Shi SỐ
chủng 1 DE 0 2 SK(1:1) - 9,0 0,13 1 3 SK(5:1) ức chế - - - - - - - - - 1 4 ST(5:1) ức chế - - - - - - - - - 1 5 C ( l:l) - 9,0 0,11 1 6 C (5:l) 9,17 0,13 10,75 0,11 - - - - ức chế - - - 3 7 E (5 :l) 9,28 0,04 11,08 0,14 9,0 0,0 - - - 8,08 0,04 - - - 4 8 Benzathin Penicilin G 22,0 0,0 11,0 0,0 19,49 0,07 3 9 Gentamicin - - - - - - 17,16 0,14 - - - 1
Nhận xét:
- Các chế phẩm đem thử hầu hết có tác dụng từ yếu đến trung bình. Phổ tác dụng của các chế phẩm thử nhìn chung không giống nhau và có tính chọn lọc ngẫu nhiên.
- Nhìn chung dạng nước sắc 1:1 có tác dụng diệt khuẩn tốt hơn dạng nước sắc 5:1. Đây có thể là do ảnh hưởng của các tạp chất làm giảm tốc độ khuếch tán các chất kháng khuẩn.
- Nước sắc tươi và khô 5:1 mới chỉ có tác dụng ức chế nên không đo được chính xác kích thước vòng vô khuẩn.
- Vi khuẩn chịu tác dụng vói nhiều chế phẩm nhất là Bacillus pumilus có 4 chế phẩm có tác dụng là s (1:1), c (1:1), E (5:1), c (5:1) cùng với kháng sinh chuẩn là Benzathin Penicillin G đặc biệt kích thước vòng vô khuẩn của các chế phẩm so sánh với kháng sinh chuẩn cho kết quả khá tương đương nhau.
- Các chế phẩm E (5:1), c (5:1) có tác dụng nhiều nhất vói các vi khuẩn kiểm định cụ thể:
+ E (5:1) có tác dụng với 4 chủng vi khuẩn là Bc, Bp, Bs, Pro
+ c (5:1) có tác dụng với 3 chủng vi khuẩn là Bc, Bp, Pro. Đây là kết quả khả quan.
H9a: Bacillus cereus H9b: Bacillus pumilus
2.3. BÀN LUẬN