Phương pháp điện di được xem là một công cụ được ứng dụng trong các thành phần protein của sinh vật (cây trồng, vật nuôi, thủy sản cũng như trên vi sinh vật). Ngoài ra phương pháp này còn được áp dụng trong y học để phát hiện nhanh bệnh SIDA (Steve K. Alexander, 2001) (được trích bởi Nguyễn Phúc Hảo, 2010).
Protein dự trữ được sử dụng như các dấu di truyền để tìm hiểu về những protein dự trữ bên trong loài, ảnh hưởng của môi trường, kiểm soát di truyền, tính phức tạp của phân tử và mối quan hệ protein dự trữ giữa các loài khác nhau. Dựa trên phân tích trọng lượng phân tử khác nhau của protein dự trữ mà người ta đánh giá tính đa hình và phổ biến (Phạm Văn Phượng, 2001). Bên cạnh đó, theo Võ Công Thành (2003) cũng cho rằng phương pháp điện di là một công cụ mạnh để xác định tổ tiên hoang dại và sự tiến hóa của các loài cây trồng.
Xác định độ thuần của giống cũng là một trong ứng dụng của phương pháp điện di SDS-PAGE. Phương pháp này cho kết quả chính xác hơn so với công tác khảo nghiệm giống cây trồng DUS (tính khác biệt, tính đồng nhất, tính ổn định) do DUS thường dựa trên những đánh giá về hình thái dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường (Goodrich et al., 1985).
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian: Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 5/2012 đến tháng 12/2013. Địa điểm: Phòng thí nghiệm Chọn giống cây trồng và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học, Bộ Môn Di Truyền-Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
2.2 PHƯƠNG TIỆN
2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Giống lúa Nàng Keo được cung cấp từ phòng thí nghiệm Chọn giống cây trồng và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học, Bộ Môn Di Truyền-Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
2.2.2 Thiết bị và hóa chất
Hóa chất thí nghiệm: Tris-base, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Tetra Methylethylenediamine (TEMED), Acrylamide, Coomassie Brilliant Blue R250, ethanol, KOH, HCl,…
Dụng cụ thí nghiệm: Water bath, tủ sấy, bộ nguồn chạy điện di protein SDS-PAGE, khung chạy điện di, kính dạng mini-slab gel, máy ly tâm 14.000 vòng/phút, cân phân tích, máy lắc, máy scan, máy đo quang phổ…
2.3 PHƯƠNG PHÁP
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu chung
Bước 1: Nhận giống Nàng Keo từ phòng thí nghiệm.
Bước 2: Tiến hành kiểm tra độ thuần bằng kỹ thuật protein SDS-PAGE trên 5 hạt. Đồng thời tiến hành ngâm giống và trồng ở điều kiện nhà lưới (phần hạt có chứa phôi còn lại đem trồng với số hạt đã ngâm ủ) (Vụ 1).
Bước 3: Thu hoạch riêng từng cá thể và chọn lọc các cá thể có thời gian trổ sớm hơn các cá thể còn lại, lấy chỉ tiêu nông học.
Bước 4: Từ Vụ 1, chọn lọc các cá thể có thời gian sinh trưởng ngắn, chiều cao cây thấp so với các cá thể còn lại. Tiến hành kiểm tra khả năng kháng rầy và khả năng chịu mặn thông qua phương pháp đánh giá kiểu hình.
Bước 5: Các cá thể chịu mặn được chọn từ vụ 1 tiếp tục nhân lên và theo dõi ở điều kiện nhà lưới (Vụ 2). Kiểm tra độ đồng đều của từng dòng, chọn lọc các cá thể ưu tú, lấy chỉ tiêu nông học và thu hoạch riêng từng cá thể.
Bước 6: Tiến hành phân tích phẩm chất hạt gạo theo các tiêu chuẩn như: nhiệt trở hồ, độ bền thể gel, hàm lượng amylose, hàm lượng protein. Sau đó tiến hành điện di tổng số để kiểm tra độ thuần.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể
Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu nông học
Thời gian sinh trưởng của lúa là thời gian từ khi hạt lúa nảy mầm cho đến khi thu hoạch (chín 85% bông trên toàn lô thí nghiệm).
Khi cây lúa sinh trưởng tối đa, tiến hành đo chỉ tiêu chiều cao. Đo từ mặt đất đến đỉnh bông cao nhất.
Khi thu hoạch, tiến hành đo chiều dài bông của 3 bông/bụi, đo chiều dài, rộng lá cờ và tính trung bình.
Đếm số bông/bụi.
Đếm số hạt chắc trên bông, tính tỷ lệ hạt chắc. Phương pháp điện di protein tổng số
Được tiến hành theo phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Doecyl sulfate Polyacrylamine Gel Electrophories)
Quy trình gồm 6 bước:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch ly trích: Kit L (Tris HCl 0,05 M (pH = 8) + SDS 0,02% + Ure 5 M) và 2-Mercaptoethenol (2-ME) 1%.
- Dung dịch làm gel A: Tris HCl 3 M (pH = 8,5), SDS 0,4%. - Dung dịch làm gel B: Tris HCl (pH = 6,5), SDS 0,4%.
- Dung dịch làm gel C: Acrylamide 29,2%, bis Acrylamide 0,8% thêm nước cất đến 100 ml.
- Dung dịch đệm điện di: Tris HCl 0,025 M, Glycine 0,192 M và SDS 0,125%. - Thuốc nhuộm: Coomassie Brilliant Blue R250 (CBBR-250) 0,225 M trong Methanol 0,225 M, acid acetic, nước cất theo tỉ lệ 44:0,6:50.
Bước 2: Ly trích mẫu
- Lấy 3 mg bột nội nhũ (không có phần phôi) nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml. - Thêm 100 µl dung dịch trích.
- Lắc ít nhất trong 3 giờ hoặc để qua đêm. - Ly tâm 1400 vòng/phút.
Bước 3: Chuẩn bị gel
- Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuôn làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra bảng tương quan giữa lượng và phần gel để xác định thành phần các dung dịch.
- Làm gel phân tách 12% Polyacrylimide và gel cô mẫu 5% Polyacrylimide theo quy trình của Sambrook (1989).
+ Làm gel phân tách 12% Polyacrylimide.
Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để yên trong 30-60 phút gel sẽ đông.
+ Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylimide.
Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ. Thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm một giọt nước, để yên trong 30-60 phút, lấy răng lược ra, lắp vào khung điện di, cho dung dịch điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.1 Công thức pha dung dịch tạo gel
Hóa chất (1 gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất 1,6 0,68 30% Acrylamide 2,0 0,17 1,5 M Tris HCl (pH = 8,8) 1,3 - 1 M Tris HCl (pH = 6,8) - 0,13 10% SDS 1,1 0,03 10% Amonium persulfate 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001
Bước 4: Tiến hành điện di
- Bơm 10 µl dung dịch ly trích mẫu/giếng
- Chạy điện di với hiệu điện thế 20 V ở gel cô mẫu và 40 V ở gel phân tách
Bước 5: Nhuộm và rửa gel
- Gel được nhuộm trong 2 giờ bằng dung dịch nhuộm Coomasie 0,2% Billiant Blue R250.
- Rửa gel trong dung dịch acid acetic: methanol: nước theo tỉ lệ 20:05:75, hoặc rửa trong miccrowave trong 30 phút.
Bước 6: Đọc kết quả, Scan và bảo quản mẫu gel.
Phương pháp xác định hàm lượng Protein (theo phương pháp Lowry, 1993)
Quy trình phân tích hàm lượng protein gồm 4 bước:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích.
- Dung dịch NaOH 0,1 N.
- Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1 N). - Dung dịch B ( CuSO4 0,1%).
- Dung dịch C (45 ml dung dịch A + 5 ml dung dịch B). - Dung dịch Folin 1 N.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu.
Cân 10 mg nội nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml, thêm vào 1 ml dung dịch NaOH 0,1 N.
Khuấy cho đều rồi để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo.
- Wortex mẫu.
- Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút 100 µl dịch trích cho vào ống 10 ml đối với mẫu thử. Đối với mẫu Blank, thay dịch trích bằng 100 µl dung dịch NaOH 0,1 N.
- Thêm 1ml nước cất, lắc đều.
- Thêm 500 µl dung dịch C (chỉ pha trước khi sử dung 30 phút), lắc đều và để yên trong 10 phút.
- Thêm 50 µl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút. Sau đó cho vào cuvette và đo ở bước sóng 600 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả.
- Pha dung dịch gốc Bovine serum abumin (BSA). - Đường chuẩn có dạng:
Y=aX+b
+ Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng protein có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lượng protein theo công thức:
100 m X %Protein 14 100 %) 100 ( 10 H m
Trong đó H%: độ ẩm của mẫu
Phương pháp xác định hàm lượng Amylose (theo phương pháp Cagampang và Rodriguez, 1980)
Quy trình gồm 4 bước:
Bước 1 : Chuẩn bị hoá chất
- Enthanol 95%. - HCl 30% - NaOH 1 N
- Dung dịch Iod ( Iod 0,2% và KI 2%).
Bước 2 : Chuẩn bị mẫu.
- Lấy thêm 50 mg nội nhũ đã được nghiền mịn, cho vào ống 50ml. - Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
- Thêm 9,5 ml NaOH 1 N.
- Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Wortex mẫu trước khi hút dịch trích.
Bước 3: Pha loãng và đo mẫu
- Rút 100 µl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu Blank thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 1 N).
- Thêm nước cất khoảng ½ bình, lắc đều. - Thêm 250 µl HCl 30%, lắc đều.
- Thêm 250 µl dung dịch Iod, lắc đều. - Thêm nước cất đến vạch định mức.
- Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả. - Đường chuẩn có dạng :
Y= aX+b
+ Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lượng amylose theo công thức:
% Amylose = 5 , 0 X x 100
+ Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như ở Bảng 2.2
Bảng 2.2 Hệ thống chuẩn hàm lượng amylose cho lúa (IRRI, 1988)
Nhóm Đặc tính Hàm lượng amylose (%) - Gạo nếp Dẻo 0-2 - Gạo tẻ: + Rất thấp Dẻo trung bình 3-10 +Thấp Dẻo trung bình 11-19 +Trung bình Cứng cơm 20-25 +Cao Rất cứng cơm >25 Phương pháp xác định cấp độ trở hồ
Tiến hành theo phương pháp IRRI (1979).
- Chuẩn bị mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy 6 hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa Petri.
- Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.
- Đậy đĩa pitri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt theo thang điểm của IRRI (1979) được trình bày ở Bảng 2.3
Bảng 2.3 Phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979)
Cấp Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên
2 Hạt gạo phòng lên
3 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên hay rõ nét. 4 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên và nở rộng. 5 Hạt gạo rã ra; viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt tan ra hòa tan với viền.
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức: Cấp trở hồ N n Xi Trong đó: Xi : cấp độ trở hồ. n : số hạt có cấp nhiệt trở hồ xi. N: số hạt thử nghiệm
Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.4)
Bảng 2.4 Đánh độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979)
Cấp Nhiệt trở hồ
1-3 Cao
4-5 Trung bình
6-7 Thấp
Phương pháp xác định độ bền thể gel
Theo phương pháp của Tang et al. (1991).
Bước 1: Chuẩn bị mẫu.
- Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
- Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).
Bước 2: Hòa tan mẫu.
- Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. - Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Wortex.
- Đậy nấp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 5 phút. - Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 20 phút.
Bước 3: Đọc và ghi kết quả.
- Để ống nghiệm nằm yên trên bề mặt bằng phẳng, để gel chạy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
- Đánh giá độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996) như được trình bày ở Bảng 2.5
Bảng 2.5 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996)
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80-100 Rất mềm
3 61-80 Mềm
5 41-60 Trung bình
7 35-40 Cứng
Phương pháp phân loại chiều dài và rộng hạt gạo
Để đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li hay thước đo, mỗi dòng lấy 10 hạt gạo xếp theo chiều dọc và 10 hạt gạo xếp theo chiều ngang.
Tiến hành đo và lấy trung bình.
Số liệu thu được sẽ đánh giá bằng tiêu chuẩn phân loại của Việt Nam (2001) (Bảng 2.6 và Bảng 2.7)
* Phân loại theo số đo chiều dài hạt gạo (Tiêu chuẩn Việt Nam, 2001)
Bảng 2.6 Phân loại hạt gạo theo chiều dài
STT Dạng hạt Chiều dài Thang chuẩn
1 Rất dài >7,5 1
2 Dài 6,61-7,5 3
3 Trung bình 5,51-6,6 5
4 Ngắn >5,51 7
* Phân loại theo tỉ số chiều dài/rộng hạt (Tiêu chuẩn Việt Nam, 2001)
Bảng 2.7 Phân loại theo tỉ số dài/rộng
STT Dạng hạt Tỉ số dài/rộng Thang chuẩn
1 Thon dài >3 1
2 Trung bình 2,1-3 3
3 Hơi tròn 1,1-2 5
4 Tròn >1 7
Phương pháp thanh lọc tính kháng rầy nâu
Phương pháp đánh giá kiểu hình.
Bước 1: Chuẩn bị giống lúa:
Sử dụng giống lúa chuẩn kháng: BN2, giống chuẩn nhiễm: TN1 làm đối chứng và các dòng lúa cần thử tính rầy.
Bước 2: Chuẩn bị lúa cho rầy ăn:
Lúa Tài Nguyên mùa (có thể sử dụng giống Jasmine 85) 10 ngày tuổi bón phân với công thức 200 N để cây lúa phát triển nhanh và tốt, khi lúa từ 20-25 ngày tuổi có thể dùng cho rầy ăn.
Bước 3: Nuôi rầy:
Rầy nâu cái trưởng thành (bụng phình to) được bắt về nuôi trong lồng lưới để rầy đẻ trứng và nở thành rầy cám 1-2 tuổi, đồng thời với lúa ở giai đoạn 2 lá mầm cao
Bước 4: Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Các dòng lúa thử nghiệm được ngâm ủ đồng thời với thời điểm rầy đẻ trứng. Sau khi giống vừa mọc mầm thì tiến hành cấy vào khay mạ 50x50x5 cm mỗi hàng 15 hạt cách nhau 2 cm, hàng cách hàng 4 cm, có bố trí giống chuẩn kháng và chuẩn nhiễm.
Khi mạ được 2 lá thật tiến hành thả rầy đồng tuổi 1-2 với mật số 4-6 con/cây. Theo dõi và lấy chỉ tiêu khi giống chuẩn nhiễm cháy rụi ở cấp 9 theo thang đánh giá của IRRI.
Bảng 2.8 Đánh giá khả năng kháng rầy theo IRRI (1996)
Cấp bệnh Đánh giá Biểu hiện
0 Rất kháng Không thiệt hại
1 Kháng Thiệt hại nhẹ
3 Hơi kháng Lá thứ 1 và thứ 2 của hầu hết các cây bị vàng 1 phần
5 Hơi nhiễm Cây vàng, phân nữa số cây héo hoặc chết
7 Nhiễm Hơn phân nữa số cây chết, còn lại còi cọc nặng
9 Rất nhiễm Tất cả mọi cây đều chết
Phương pháp thanh lọc khả năng chịu mặn
Bước1: Hạt giống thử nghiệm phải được xử l ý nhiệt trong 5 ngày trong tủ sấy ở 50oC để phá vở miên trạng của hạt giống. Sau khi phá vở miên trạng, khử trùng hạt giống với thuốc diệt nấm và rửa sạch với nước cất. Đặt hạt tiệt trùng trong đĩa petri với giấy lọc ẩm và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ để lúa nảy mầm.
Bước 2: Gieo hai hạt nảy mầm ở mỗi lỗ trên tấm xốp (mười lỗ tương ứng 20 hạt/giống/dòng. Trong ba ngày đầu chỉ để cây con trên khay xốp chứa đầy nước cất. Lưu ý: Giữ cây con nguyên vẹn, hạn chế tác động đến cây con.
Bước 3: Sau 3 ngày, khi cây con phát triển tốt, thay thế nước cất bằng dung dịch dinh dưỡng mặn Yoshida (1976). Lưu ý: Hằng ngày kiểm tra mực nước, thêm nước cất đúng 3 lít vào các khay mặn.
Bước 4: Đối với dung dịch thử mặn sau mỗi 8 ngày. Chuẩn độ pH = 5 sau mỗi ngày.
Đánh giá khả năng chịu mặn:
Thường xuyên theo dõi thí nghiệm, đến khi giống chuẩn nhiễm IR29 chết hoàn toàn (cấp 9).
Đánh giá sự chống chịu mặn của cây mạ bằng thang đánh giá của IRRI (1997)
Bảng 2.9 Tiêu chuẩn đánh giá ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển (IRRI, 1997)