5. Điểm mới của đề tài
2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh
2.2.2.1.Nuôi cấy chủng nấm để thử hoạt tính
Các chủng nấm tuyển chọn đƣợc nuôi cấy trải dày trên môi trƣờng giữ giống trong đĩa petri, nuôi trong tủ ấm từ 3 đến 5 ngày.
2.2.2.2.Xác định hoạt tính enzim bằng phương pháp cấy chấm điểm
Định tính celluase bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trƣờng thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm một điểm vào môi trƣờng thạch đĩa chứa 1% cơ chất CMC, nuôi trong tủ ấm 3 đến 4 ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử liugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme đƣợc xác định bằng hiệu số (D – d) cm.
D : là đường kính vòng phân giải, d là đường kính khuẩn lạc.
2.2.2.3. Xác định hoạt tính enzim bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983)
Dùng khoan nút chai khoan 1 lỗ trên môi trƣờng thử hoạt tính. Nhỏ vào mỗi lỗ khoan 1ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6h-8h cho enzyme khuếch tán vào môi trƣờng thạch, sau đó cho vào tủ ấm 300C trong 24h. Hiện hình vòng phân giải bằng thuốc thử liugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme đƣợc xác định bằng hiệu số (D – d) cm.
29
2.2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính cellulase
* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 250C đến 400C trong 36h. Hoạt tính cellulase của các dịch đƣợc xác định theo phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch. * Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức thời gian khác nhau từ 12h đến 48h. Sau khoảng thời gian 12h, 24h, 36h, 48h, xác định hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch.
* Xác đinh ảnh hưởng của độ ẩm nuôi cấy
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức độ ẩm khác nhau (50 - 80%). Hoạt tính cellulase của các dịch đƣợc xác định theo phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch.
* Xác định ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên
Nguồn cacbon lần lƣợt đƣợc sử dụng là vỏ trấu, lõi ngô, vỏ lạc, nuôi cấy chủng trong thời gian 36h, sau đó lấy dịch, xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch. * Xác định ảnh hưởng của các nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trƣờng Czapek - Dox thích hợp với nguồn nitơ đƣợc sử dụng lần lƣợt là : NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, pepton trong thời gian là 36h. Sau đó lấy dịch enzyme, xác định hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch.
30
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose
Qua quá trình nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose, đã phân lập đƣợc 25 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase. Hoạt tính cellulase của các chủng đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1. Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose (D-d) cm
Mẫu STT Chủng mốc Đặc điểm của chủng Màu của khuẩn lạc Thời gian xuất hiện Hoạt tính cellulase D-d (cm) Lá cây mục 1 M1-51 Đen 2 ngày 1.7 2 M1-52 Nâu trắng 3 ngày 1.0 3 M1-61 Đen 2 ngày 0.6 4 M1-62 Tím đen 3 ngày 0.5
5 M1-9 Xanh rêu 2 ngày 0.6
6 M1-10 Trắng 2 ngày 0.7 Gỗ cây mục 7 M2 -1 Xám 3 ngày 1.2 8 M2-3 Xám đậm 3 ngày 0.5 9 M2-4 Xanh 3 ngày 0.3 10 M2-51 Nâu đậm 1 ngày 1.9 11 M2 -52 Nâu 2 ngày 1.2 12 M2-6 Nâu 3 ngày 1.2 13 M2-7 Xám nhạt 2 ngày 0.6 14 M2-8 Nâu đậm 3 ngày 0.7 Đất mùn
15 M3-4 Xanh Đen 1 ngày 0.5
16 M3-8 Trắng vàng 2 ngày 0.8 17 M3-10 Nâu 3 ngày 0.5 Rơm dạ mục 18 M4-1 Vàng 3 ngày 1.4 19 M4-2 Trắng xanh 2 ngày 0.5 20 M4-3 Xanh mốc 2 ngày 0.4 21 M4 D Đen 2 ngày 1.0 22 M4 XT Xanh trắng 1 ngày 0.4 23 M4-V Vàng xanh 2 ngày 2.0 24 M4 -7 Nâu nhạt 3 ngày 0.6
31
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng nấm mốc M151
Hình 3.2. Khả năng sinh cellulase của các chủng được nghiên cứu
Trong số 25 chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose đã phân lập đƣợc tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Sinh – KTNN, trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, có tới 9 chủng có hoạt tính enzym lớn hơn 1cm, 16 chủng có hoạt tính
32
enzyme nhỏ hơn 1 cm. Trong đó có 3 chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase mạnh nhất đó là các chủng có kí hiệu M4v (đƣờng kính vòng phân giải là 2 cm), M251 (đƣờng kính vòng phân giải là 1,9 cm), và M151 (đƣờng kính vòng phân giải là 1,7 cm). So sánh kết quả này với các nghiên cứu trƣớc đó nhƣ Trịnh Đình Khá (2007), thì 3 chủng thu đƣợc có hoạt tính cellulase cao. Tuy nhiên để cho việc nghiên cứu đƣợc sâu hơn và đạt đƣợc kết quả chính xác nhất, tôi sẽ nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng sinh cellulase của chủng M151. Có thể hy vọng rằng chủng M151 sinh trƣởng và phát triển tốt trên nguồn cơ chất rẻ tiền, có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme với hoạt tính cao sẽ có nhiều ứng dụng hiệu quả trong thực tiễn, đặc biệt là sinh enzyme để bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi.
3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủngM151 của chủngM151
3.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cellulose tự nhiên
Nguồn cacbon có ảnh hƣởng lớn đến khả năng tạo sinh khối và sinh enzyme của nấm. Nó có vai trò nhƣ một chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulose. Do đó, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulose của chủng nấm tuyển chọn.
Chủng M151 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng rắn thích hợp với nguồn cacbon lần lƣợt là vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô, sử dụng nguồn dinh dƣỡng khoáng là môi trƣờng Czapek - Dox thích hợp trong thời gian 4 ngày, sau đó lấy dịch nuôi cấy, đem li tâm, loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch (William, 1983). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
33
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng sinh cellulose của chủng mốc M151
Chủng nấm mốc
Khả năng sinh cellulase D-d (cm) Vỏ trấu Vỏ lạc Lõi ngô
M151 1,6 1,3 0,7
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulase của chủng M151
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng M151 tuyển chọn đƣợc, có khả năng phân giải nguồn cơ chất tự nhiên để sinh cellulase. Vỏ trấu là nguồn cellulose tự nhiên tốt nhất cho sƣ phát triển và sinh tổng hợp enzyme. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn nguồn cacbon rẻ tiền để lên men thu enzyme bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu đi trƣớc, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh trong những môi trƣờng có nguồn cacbon tự nhiên (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh etal.,2003; Vũ Ngọc Mai (k32-sp2), 2010).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 Lõi ngô Vỏ trấu Vỏ lạc
34
3.2.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng M151 khả năng sinh cellulase của chủng M151
Chủng M151 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng rắn thích hợp với nguồn cacbon phối trộn vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô theo các tỉ lệ khác nhau lần lƣợt là 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2, và 6:3:1 sử dụng nguồn dinh dƣỡng khoáng là môi trƣờng Czapek- Dox thích hợp trong thời gian 4 ngày, sau đó cân 1mg mẫu + 1ml nƣớc, cho vào ống nghiệm lắc đều, để lắng lấy dịch. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch (William, 1983). Kết quả thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm đến khả năng sinh cellulase của chủng nẩm mốc M151
Nguồn các bon Hoạt tính cellulase của chủng M151 (D-d) cm
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô
4:3:3 1,6
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô
4:4:2 2,1
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô
6:2:2 1,9
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô
35
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nguồn cellulose phối trộn đến khả năng sinh cellulase của chủng M151
Tỷ lệ 4:4:2 Tỷ lệ 4:3:3
Hình 3.5. Khả năng sinh cellulase ở các tỷ lệ phối trộn cellulose tự nhiên
Vậy từ kết quả thu đƣợc nhƣ trên có đƣợc kết luận rằng, chủng M151 có khả năng phân giải nhiều nguồn cơ chất cellulose tự nhiên để sinh cellulase. Qua nghiên cứu một số tỷ lệ phối trộn, cho thấy tỷ lệ 4:4:2 là tốt nhất để chủng M151 sinh tổng hợp cellulase.
36
3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc M151 trên môi trƣờng rắn theo tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: 4 vỏ lạc: 2 lõi ngô) ở các mức nhiệt độ khác nhau. Sau 36 giờ lên men, xác định hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase của chủng M151
Từ kết quả thu đƣợc ở trên, tôi đƣa ra kết luận rằng chủng M151 có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở 300
C, sau đó thì khả năng này giảm dần ở các mức nhiệt độ tiếp theo là 350C, 400C.
Chủng VSV
Hoạt tính cellulase (D-d) cm
25oC 30oC 35oC 40oC
37
Các chủng nấm thƣờng là các chủng ƣa nhiệt và nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp cellulase là 300C trong các nhiệt độ khảo sát. Những nghiên cứu trƣớc đây đều cho thấy, các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao ở dải nhiệt độ từ 310C – 340C (Đặng Minh Hằng, 1999). Nhiệt độ thích hợp với đa số nấm mốc là 300
C - 320C [13].
Vậy qua nghiên cứu của tôi thì chủng M151 sinh cellulase cao ở dải nhiệt từ 300C – 350C.
3.2.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy
Chủng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng rắn với tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: 4 vỏ lạc: 2 lõi ngô) ở các mức thời gian khác nhau từ 12h – 48h. Sau 12h, 24h, 36h, 48h, lấy 1ml mẫu với 1ml nƣớc bỏ vào ống nghiệm, lắc đều rồi để trong lấy phần dịch. Xác định hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Chủng VSV Hoạt tính cellulase (D-d) cm 12h 24h 36h 48h M151 0,7 1,3 1,7 1,5
38
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng M151
Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36h-60h. Mốc A.oryzae và
A.awamori nuôi trên môi trƣờng cám để sản xuất amylase khoảng 36h – 40h. Nhiều chủng Aspergillus tạo thành enzyme cao nhất lúc mới bắt đầu sinh bào tử [11].
Kết quả thu đƣợc ở trên cho thấy, hoạt tính cellulase của chủng tăng dần theo thời gian và đạt giá trị lớn nhất sau 36 giờ nuôi cấy. Sau 36 giờ nuôi cấy hoạt tính của chủng nghiên cứu giảm dần, nguyên nhân có thể do sinh trƣởng của nấm mốc giảm dần, các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt…
3.2.5. Ảnh hƣởng của độ ẩm
Chủng M151 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng rắn với tỷ lệ phối trộn (4 vỏ trấu: 4 vỏ lạc: 2 lõi ngô) ở các mức độ ẩm khác nhau từ 50% - 60%. Sau 36 giờ lên men ở 300C, xác định hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6.
39
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh cellulase
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh cellulasecủa chủng M151
Chủng VSV
Hoạt tính cellulase (D-d) cm
50% 60% 70% 80%
40
Hình 3.10. Khả năng sinh cellulase của chủng M151 ở các mức độ ẩm
Kết quả thí nghiệm trên cho thấy độ ẩm cơ chất (4:4:2) thích hợp cho chủng M151 phát triển tốt nhất là 70% và hoạt tính enzyme là cao nhất với đƣờng kính phân giải là 2,4 cm. Điều này phù hợp với công bố của tác giả Trịnh Đình Khá và cs cho rằng ở độ ẩm 60-70% nấm mốc thuộc chủng
Penicillium sp cho sinh khối và enzyme lớn nhất [10].
3.2.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Cellulose là một loại polysaccarit khó bị phân giải, do đó tế bào vi sinh vật muốn phân giải đƣợc thì phải tổng hợp đƣợc một lƣợng lớn cellulase, vì thế quá trình sinh tổng hợp có thể cần tới lƣợng lớn nitơ, có chủng có thể sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm mốc trong quá trình lên men có ý nghĩa rất quan trọng.
Chủng nấm mốc M151 tuyển chọn đƣợc đem nuôi cấy trên môi trƣờng Czapek – Dox thích hợp (môi trƣờng rắn) với nguồn nitơ đƣợc sử dụng lần
41
lƣợt là NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, pepton. Sau đó xác định hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp khuếch tán trên môi trƣờng thạch. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Chủng VSV
Hoạt tính cellulase (D-d) cm
Pepton NaNO3 (NH4)2SO4 NH4Cl
M151 2,5 2,1 1,9 2
Hình 3.11. Biểu đồ biểu biễn ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase của chủng M151
Sau 36h lên men rắn với tỷ lệ cơ chất (4 vỏ trấu: 4 vỏ lạc: 2 lõi ngô) ở nhiệt độ 300C và độ ẩm 70%. Kết quả thu đƣợc ở bảng số liệu, cho thấy chủng M151 có khả năng sử dụng nhiều nguồn nitơ. Trong các nguồn nitơ đƣợc nghiên cứu thì pepton là tốt nhất cho sự sinh tổng hợp cellulase với hoạt tính enzyme là 2,5 cm, sau đó là NaNO3 với hoạt tính enzyme là 2,1 cm.
42
Nhƣng nếu sử dụng nguồn dinh dƣỡng nitơ hữu cơ trong sản xuất thì hiệu quả kinh tế lại thấp do giá thành cao. Vì vậy ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ vô cơ là muối NaNO3. Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu cho rằng nitrat là nguồn nitơ thích hợp cho tổng hợp cellulase ở nhiều nấm sợi nhƣ
Aspergillus, Trichoderma… Các muối nitrat là nguồn thức ăn thích hợp với nhiều xạ khuẩn, nấm mốc và tảo [18]. Acharya và cs (2008) khi nghiên cứu trên chủng A.niger cho thấy pepton, ammonium sunfate và ure là nguồn nitơ thích hợp cho chủng A.niger sinh tổng hợp cellulase.
43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Từ 25 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase phân lập đƣợc từ các mẫu cành gỗ, lá cây, rơm rạ mục, đất mùn ở Hà Nội, Vĩnh Phúc, đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng M151, M4v, M251 có khả năng tổng hợp cellulase cao. Trong đó tôi đi sâu tìm hiểu chủng M151.
1.2. Nghiên cứu một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng M151 và rút ra điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng M151 là:
Nhiệt độ thích hợp là 300C. Thời gian lên men rắn là 36 giờ. Độ ẩm thích hợp là 70%. Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất là NaNO3 , hữu cơ tốt nhất là pepton. Nguồn cellulose tự nhiên thích hợp là vỏ trấu, nguồn cellulose phối trộn thích hợp với tỷ lệ là 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô).
2. Kiến nghị
2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và định loại chủng M151.
2.2. Kết quả này bƣớc đầu cho thấy chủng M151 có khả năng ứng dụng để