Chơng 3 Kết quả và thảo luận
3.4.2.Kết quả biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Hình 7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% M. Thang ADN 1 Kb; 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG
Sản phẩm thôi gel, sau đó đợc gắn vào vectơ pGEM-T dới sự xúc tác của T4 ligase. Phản ứng gắn (ligation) dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste giữa nucleotit Adenine của sản phẩm PCR và nucleotit Thymine của vectơ. Các thành phần của vectơ pGEM-T đợc thể hiện trong phụ lục 2. Hỗn hợp phản ứng đợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vectơ tái tổ hợp sau đó đợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và đợc cấy trải trên môi trờng LB đặc có bổ sung Ampicillin 100mg/l, X-gal 0,004‰, và IPTG 100àM. ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Thành công của thí nghiệm này phụ thuộc vào hai yếu tố: thứ nhất là sản phẩm PCR phải đặc hiệu thì quá trình gắn vào vectơ mới đạt hiệu suất cao. Thứ hai là tế bào khả biến phải đợc chuẩn bị tốt, đúng quy trình mới tăng đợc hiệu suất biến nạp. Kết quả đợc trình bày trên hình 8.
Kết quả, chúng tôi đã thu đợc một lợng lớn cả khuẩn lạc xanh và trắng. Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trờng có Ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit. Vì sự có mặt của gen kháng Ampicillin trong plasmit mang đến cho vi khuẩn tính kháng Ampicillin. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do trong vectơ pGEM-T mang lac-operon hoạt động bình thờng, không có đoạn gen đợc chèn vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận đợc plasmit mang lac-operon không hoạt động, chính vì vậy, khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzym β-galactosidase và không xảy ra sự chuyển hoá X-gal. Lac-operon bị bất hoạt là do đoạn ADN ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Chính vì vậy lac-promoter không thể điều khiển gen
cấu trúc phiên mã, nên không có sự dịch mã thành enzym. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn ADN thuộc gen NIb. Mặc dù vậy, việc chọn các khuẩn lạc trắng để tiến hành nghiên cứu tiếp đã loại bỏ đợc phần lớn các trờng hợp không mong muốn. Để hiệu quả hơn, chúng tôi tiếp tục tiến hành chạy phản ứng colony PCR.