2.1.2.1 Phương pháp chiết bromelain trong quả dứa
— Dùng phương pháp cơ học phá vỡ cấu tạo tế bào, giải phóng ra bromelain từ lõi quả dứa. Kết tinh nhiều lần bromelain bằng muối ammonium sulfat bão hoà. Đem sấy ở 40°c thu được bromelain thô [3].
— Định tính dựa trên khả năng thuỷ phân protein của bromelain. Tiến hành như sau:
+ Bromelain thô đem hoà tan trong nước cất, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, loại tạp, thu phẩn dịch có chứa bromelain tan trong nước. Sau đó tiến hành như bảng sau:
Thành phần Ống thử Ống chứng
Casein 0.6% 5 ml 5 ml
Cystein 0.04M 0 .2 ml 0 .2 ml
Dịch bromelain 0 .8 ml 0
Nước cất 0 0 .8 ml
+ Lắc đều, ủ 37°c trong 10 phút, thêm từ từ 5 ml acid trichloroacetic lắc đều. Để yên 30 phút ở nhiệt độ 37°c, quan sát và so sánh mức độ tạo tủa trong ống thử và ống chứng.
2.1.1.2 Kỹ thuật định lượng protein bằng phương pháp biuret
— Nguyên tác: protein có liên kết peptid cho tác dụng với CuS04 trong môi trường kiềm tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ so với biểu đồ mẫu để định lượng protein.
— Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng biuret Cân l,00g albumin bò tinh khiết, hoà tan với dung dịch NaCl 0,9% vừa đủ để có dung dịch 1%. Từ dung dịch này ta thực hiện phản ứng theo bảng sau:
Thuốc Thử ✓ Ông Nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dd Albumin l%(ml) 0 .1 0 .2 0.3 0.4 0.5 0 .6 0.7 0 .8 0.9 1 Dd N aQ 0,9% (ml) 0.9 0 .8 0.7 0 .6 0.5 0.4 0.3 0 .2 0 .1 0 Thuốc thử Gomall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút, đo quang ở
bước sóng 550nm. Từ kết quả đo quang phổ hấp phụ thu được của các dung dịch, xây dựng biểu đồ nồng độ protein (mg/ml) - mật độ quang (D).
Ta thu được kết quả như bảng sau:
c
(mg/ml)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(D) 0.013 0.057 0.093 0.140 0.169 0.209 0.244 0.283 0.322 0.368
Từ kết quả trên, thiết lập và vẽ biểu đồ mẫu biểu diễn sự phụ thuộc giữa mật độ quang (D) và nồng độ protein (mg/ml):
D Biểu đồ mẫu
Hình 4: Sự phụ thuộc giữa mật độ quang (D) và nồng độ protein (C)
Từ biểu đồ chuẩn cho thấy, sự biến thiên của mật độ quang tuyến tính bậc một theo nồng độ protein. Như vậy ta có thể xác định được lượng protein đã bị thuỷ phân bởi enzym (A).
2.1.1.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzym
— Nguyên tác: cơ chất được ủ với enzym ở điều kiện thích hợp trong thời gian nhất định. Lượng tủa còn lại được xác định bằng cách cho tủa với acid trichloroacetic, tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 550nm.
— Tiến hành:
+ Pha chế enzym đến nồng độ thích hợp bằng nước cất. + Xác định khả năng thuỷ phân protein của enzym
Tiến hành phản ứng theo bảng sau: Thuốc Thử (ml) Ống cơ chất(D l) Ống thử(D2) Ống chứng(D3) Dd casein 0,6% 2 .0 2 .0 0 Acid tricloroacetic 10% 2.5 0 2.5 Dd đệm pH thích hợp 1.5 1.5 1.5 Cystein 0,04M 0.5 0.5 0.5 Dd enzym n % 0 0.5 0.5
— Lắc đều, ủ ấm trong 37° trong 60 phút. Sau thời gian ủ ấm, cho vào ống thử 2,5ml acid trichloroacetic 10%. Lắc kỹ để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, đem ly tâm lấy tủa. Hoà tan tủa với 4ml thuốc thử Gomall, lắc kỹ để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo mật độ quang ở bước sóng 550nm.
— Cách tính kết quả:
+ Đơn vị hoạt độ: là số mol có chất bị thuỷ phân bởi Img enzym trong 1 giây.
—> Hoạt độ enzym được tính theo công thức:
W>ti7 _ AxBx10*x209 , * n
HđE = — ' " , “ (nanoKatal) (*) (236 x lO ') x T x m
Trong đó: A : Lượng protein (mg) bị thuỷ phân (xác định theo biểu đồ). B : Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym. 23600 : Trọng lượng phân tử gam của casein (g). 209 : Số liên kết peptid của một phân tử casein.
T : Thời gian thuỷ phân (giây),
m : Lượng chế phẩm enzym đem thử (mg).
Katal là số mol cơ chất bị thuỷ phân bởi Img enzym trong một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
—> Hoạt độ enzym theo % được tính theo công thức:
D,-D,-D3
H đP (%) = --- X 100% D,
Trong đó: D i : Mật độ quang của ống cơ chất. D2: Mật độ quang của ống thử.
Da : Mật độ quang của ống chứng
2.1.1.4 Phương pháp xử lý thống kê y học các mẫu nghiên cứu
— Tính giá trị trung bình M
+ M = (n, + n2 + n3)/3, trong đó: ri|,n2,n3 là giá trị lần đo thứ 1,2,3- — Tính độ lệch tiêu chuẩn ô
+ Độ lệch tiêu chuẩn là sự biến đổi của những kết quả riêng biệt xung quang trị số trung bình M. Công thức tính độ lệch chuẩn ô :
ô = i n - l
Trong đó: Xj : kết quả đo lần thứ i (i = 1,2,3,• • • ,n).
M : giá trị trung bình của các kết quả giữa các lần đo.
n : số lần đo.
—)• Như vậy ta có kết quả của mẫu nghiên cứu là: M ± ô