2.2.1 Chiết, tách và tạo chê phẩm bromelain từ dứa
— Quả dứa gần chín (khoảng 1 tháng trước khi chín ), lấy phần lõi dứa, đem xay nghiền nhỏ trong dung dịch đệm acetat pH = 4.8 có mặt muối ammonium Sulfat 14%, EDTA O.OOIM, cystein 0.02 M.
^ Khối lượng phần lõi dứa đem xay là: m = 150g cùng với: + 28g ammonium Sulfat hoà tan trong 90ml nước cất
+ CyStein 0.4M lOml + CH3COOH 0.2M 40 ml + CHaCOONa 0.2M 60 ml
Đem xay kỹ thu được ~ 250ml dịch chiết dứa.
— Dịch chiết dứa đem lọc qua gạc, thu được dịch lọc. Đo pH dịch lọc pH= 4.4
—> Thêm từ từ dung dịch ammonium Sulfat bão hoà (60- 70%) cho đến khi xuất hiện tủa thì dừng lại, để cho dung dịch ổn định ta để yên trong 1 5 -2 0 phút. Thu lấy phần tủa phía trên dung dịch. Tiến hành kết tinh bromelain như trên nhiều lần.
— Phần dịch có tủa thu được đem trộn đều với lactose tỷ lệ về khối lượng dịch có tủa 1: lactose 2.
— Đem sấy hỗn hợp trên ở 40°c cho đến khi khô, thu được bromelain thô (B,).
—> Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết tách bromelain
Hình 5: Sơ đồ tóm tắt quá trình chiết bromelain thô từ lõi dứa
— Định tính bromelain thô thu được như sau:
+ Lấy 0.5g bromelain thô mới thu được hoà tan trong lOml nước cất, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút thu phần dịch. Sau đó tiến hành như sau: Thành phần Ống thử Ống chứng Casein 0.6% 5ml 5ml Cystein 0.04M 0.2ml 0.2ml Dịch bromelain 0.8ml 0 Nước cất 0 0.8ml
— Lắc đều, ủ trong 37°c/10 phút, thêm từ từ 5ml acid trichloroacetic lắc đều. Để yên 30 phút ở nhiệt độ 37°c, quan sát lượng tủa tạo thành trong ống thử và ống chứng. Ta thấy:
+ Ống chứng có xuất hiện tủa trắng rõ rệt, do tính chất gây tủa protein
của acid trichloroacetic.
+ Ống thử chỉ xuất hiện một đám trắng lờ mờ như sương và không có tủa, đó là do enzym đã cắt casein thành các acid amin do đó không có hiện tượng tạo tủa. Tuy nhiên do enzym cắt các liên kết peptid chưa hoàn toàn do đó tạo thành đám trắng lờ mờ như trên. Như vậy có thể khẳng định có mặt bromelain trong tủa thu được.
2.2.2 Xác định hoạt độ protease của bromelain tinh
— Chế phẩm bromelain tinh khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ t°= -15°c, tiến hành xác định hoạt độ enzym:
— Từ (*) ta có: B = 14, T = 3600, m = 0.5x lOn (n là nồng độ % của enzym) —> HđE = (Ax6.8 8 8)/n
+ Bước 1: Xác định nồng độ bromelain thuỷ phân ~ 50% protein và có hoạt độ enzym là cao nhất:
Tiến hành như bảng sau với bromelain được hoà tan trong nước với các nồng độ khác nhau n (%)
Thuốc Thử (mi) Ống cơ chất(Dl) Ống thử(D2) Ống chứng(D3)
Dd casein 0.6% 2.0 2.0 0
Acid tricloroacetic 10% 2.5 0 2.5
Dd đệm pH= 6.0 1.5 1.5 1.5
Cystein 0,04M 0.5 0.5 0.5
Dd enzym n (%) 0 0.5 0.5
Kết quả thu được ở bảng là trung bình của 3 lần thí nghiệm:
n(%) D2 D3 % thuỷ phân Hoạt độ nK
1 0.076 ± 0.004 0.052 ± 0.002 0 24.5 4.3
1 0' 0.076± 0.004 0.045 ± 0.002 0 31.67 55.3
5.10-2 0.076± 0.004 0.042 ± 0.004 0 34.72 121.6
10-2 0.076± 0.004 0.059 ± 0.005 0 17.36 304.4
Bảng 4: Hoạt độ của bromelain tại các nồng độ khác nhau
Qua bảng trên ta sẽ chọn nồng độ bromelain là c= 5.10'^% làm nồng độ nghiên cứu.
— Như vậy hoạt độ của bromelain là HđB = 121.6 (nKat).
2.2.3 Xác định hoạt độ enzym của a- Chymotrypsin
— a - Chymotrypsin tinh khiết được bảo quản trong tủ lạnh ởnhiệt độ
t°= -15°c, hoà tan trong nước ở các nồng độ khác nhau, đem đo hoạt tính, nhằm
xác định nồng độ enzym mà tại đó % thuỷ phân gần với mức 50% nhất và có hoạt độ enzym là cao nhất.
— Tiến hành như bảng sau:
Thuốc Thử (ml) Ổng cơ chất(Dl) Ống thử(D2) Ống chứng(D3) Dd casein 0,6% 2 .0 2 .0 0 Acid tricloroacetic 10% 2.5 0 2.5 Dd đệm pH= 8.0 1.5 1.5 1.5 Cystein 0,04M 0.5 0.5 0.5 Dd enzym n (%) 0 0.5 0.5
Kết quả thu được ở bảng là trung bình của 3 lần thí nghiệm:
N i' % ) Di 0 2 I>3 % th u ỷ p h â n HđA nK 5.10-2 0.057 ± 0.002 0.016 ± 0 .0 0 1 0 53.17 146.8 10-2 0.057 ± 0.002 0.023 ± 0.004 0 43.11 608.7 5.10-3 0.057 ± 0.002 0.015 ± 0.002 0 53.17 1501.6 1 0-^ 0.057 ± 0.002 0.033 ± 0.004 0 30.44 4298.1 1 0'^ 0.057 ± 0.002 0.051 ±0.003 0 7.61 10779.3
Bảng 5; Hoạt đ ộ e n z y m c ủ a a - C h y m o try p sin tạ i c á c n ồ n g đ ộ k h á c n h a u
+ Qua kết quả như bảng trên ta sẽ chọn a- Chymotrypsin với nồng độ
c = 5.1 0"^ % làm nồng độ nghiên cứu.
—» Như vậy hoạt độ của a - Chymotrypsin, HđA = 1501.6 (nKat)
2.2.4 Xác định tỷ lệ phối hợp thích hợp của bromelain và AC
— Dựa trên tỷ lệ về hoạt độ enzym ta phối hợp hai chế phẩm enzym
bromelain và a- Chymotrypsin theo tỷ lệ về khối lượng cho hỗn hợp enzym có
hoạt tính enzym tương đưofng chế phẩm a- Chymotrypsin đã thay thế.
— Pha hỗn hợp AB3 gồm; a- Chymotrypsin 1 phần theo khối lượng bromelain 11 phần theo khối lượng Cụ thể là: a - Chymotrypsin, m = 0.3 g
bromelain m = 3.3 g
2.2.5 Nghiên cứu độ bền hoạt độ của hỗn hợp enzym
— Chia làm hai lô: lôl hỗn hợp enzym để trong tủ ấm t°= 45°c, lô 2 hỗn hợp enzym để điều kiện phòng thí nghiêm f= 30 (± 2)°c
+ Với lô 1, tiến hành như sau:
Thuốc Thử (ml) Ống cơ chất(D l) Ống thử(D2) Ống chứng(D3) Dd casein 0,6% 2 .0 2 .0 0 Acid tricloroacetic 10% 2.5 0 2.5 Dd đệm pH= 7.2 1.5 1.5 1.5 Cystein 0,04M 0.5 0.5 0.5 Enzym mix 2.10'^ (%) 0 0.5 0.5 31
+ Cứ một tuần xác định hoạt độ một lần, kết quả thu được là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm:
Tuần (n¡)
Lô 1 Tốc độ thay đổi hoạt độ
v¡= Hđ/iii Hoạt độ hỗn hợp (nK) Hoạt độ còn lại (%) 0 400+ 18 1 0 0 v,b= 28.9 1 374+ 18 93.5 26 2 341 ± 9 85.3 29.5 3 315± 18 78,8 28.3 4 287 ± 9 69.5 28.3 5 248 ± 9 62.0 30.4 6 221 ± 9 55.3 29.8 7 189 ± 9 47.3 30.1
Bảng 6: Sự biến đổi hoạt độ của hỗn hợp enzym khi ủ trong tủ ấm t°= 45”C (+) Ghi chú: Vị là tốc độ biến đổi hoạt độ hỗn hợp enzym qua các lần xác định Vj = Hđ„ - Hđ^.ị (n = K 7 lần).
+ Với lô 2, tiến hành như sau:
Thuốc Thử (ml) Ống cơ chất(D l) Ống thử(D2) Ong chứng(D3)
Dd casein 0,6% 2 .0 2 .0 0
Acid tricloroacetic 10% 2.5 0 2.5
Dd đệm pH= 7.2 1.5 1.5 1.5
Cystein 0,04M 0.5 0.5 0.5
Enzym mix 2.10'^ (%) 0 0.5 0.5
+ Cứ một tuần tiến hành xác định hoạt độ một lần, ]cết quả thu được ở bảng là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm:
Tuần
( H i )
Lô 2 Vj = Hd/nj
H oạt độ hỗn hợp enzyme (nK) Hoạt độ còn lại (%)
0 400 ± 9 1 0 0 v,b= 12.5 1 387 ± 9 96.8 13 2 376 ± 9 94.0 12 3 350 ± 9 90.0 13.3 4 350 ± 9 87.5 12.5 5 337 ± 9 84.3 1 2 .6 6 327 ± 9 81.8 1 2 .2 7 319 ± 9 79.8 1 1 .6
Bảng 7: Sự biến đổi hoạt độ của hỗn hợp enzym ở điều kiện tự nhiên (t”= 30”C và độ ẩm 80%)
(+) Ghi chú: hỗn hợp AB3, pha dung dịch 2.10'^ thời điểm ban đầu thuỷ phân được 49.2% protein.
^ Qua hai bảng trên ta có thể đưa ra: sự biến đổi hoạt độ của hỗn hợp enzym được thể hiện qua phần trăm hoạt độ còn lại tính theo thời gian trong hình 6 và tốc độ biến thiên hoạt độ của hỗn hợp enzym được biểu diễn trên hình 7.
Hình 6: Biểu diễn sự thay đổi hoạt độ của hỗn hợp enzym theo thời gian
33 u Lô 1 30 27 24 21 Ịi 8 15 12 Lô 2 0 -I---^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ---ỈTuần, I 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 7: Tốc độ biến đổi hoạt độ của hỗn hợp enzym theo thời gian
Nhân xét:
— Với lô 1, qua bảng 6 ta thấy rằng hoạt độ của hỗn hơp enzym giảm dần theo thời gian, sau 7 tuần hoạt độ của hỗn hợp chỉ còn là 47.3% và tốc độ giảm hoạt độ trung bình của hỗn hợp enzym là Vtb(i)= 28.9 nK/tuần.
— Với lô 2, qua bảng 7 ta thấy rằng không như lô 1, tốc độ giảm hoạt tính của lô 2 là chậm hơn Vjb (2)= 12.5 nK/tuần, sau 7 tuần hoạt độ của hỗn hợp enzym còn lại là 79.8%.
— Qua hình 6, rõ ràng tốc độ giảm hoạt tính enzym của lô 1 là cao hơn lô 2 rất nhiều. Tuy nhiên tốc độ giảm hoạt độ enzym của lô 1 là không ổn định [dao động trong khoảng (26; 30.4)], trong khi đó V ị của lô 2 là tương đối ổn định [dao động trong khoảng (11.6; 13.3)].
— Từ bảng 6 và (*), ta có thể tính được HđAB3 theo lượng AC ban đầu: HđABg = (Ax6.888)/3,33.10'^ = 2397 nK.
2.3 Bàn luận
* Quá trình tiến hành luận án
— Quá trình chiết bromelain từ dứa đã thu được bromelain thô, tuy nhiên ta chỉ có thể định tính bromelain thu được, còn việc định lượng là không thực hiện được do có lẫn nhiều tạp như muối, đường và việc tiến hành chiết tách
còn thủ công. Công đoạn kết tinh bromelain bằng muối ammoni Sulfat nhiều lần
sẽ giúp thu được bromelain tinh hơn. Đồng thời nếu tủa bromelain thu được, đem đông khồ, như vậy sẽ thu được bromelain sạch hơn và có thể định lượng bằng phương pháp biuret.
— Việc xác định hoạt độ của hai enzym: bromelain và a- Chymotrypsin cho ta thấy rằng ở các nồng độ khác nhau thì enzym lại có một giá trị hoạt độ khác. Do đó có thể nói rằng việc lựa chọn nồng độ enzym nghiên cứu đóng một vai trò quan trọng đảm bảo tính chính xác của việc nghiên cứu.
— Phương pháp định lượng protein bằng phản ứng biuret được sử dụng trong nghiến cứu này là một phương pháp kinh điển, việc tiến hành là khá đơn giản và phù hợp khả năng cũng như mục đích của nghiên cứu.
* Sự biến đổi hoạt độ của AB3
— Sự giảm hoạt tính của lôl và lô 2 là tương đối tuyến tính, tuy nhiên mức độ giảm hoạt tính ở 2 lô rất khác nhau.Tốc độ giảm hoạt độ enzym của lô 1 là khá nhanh Vjb = 28.9nK/tuần và gấp 2.3 lần Vjb của lô 2.
— Sự giảm hoạt độ của AB3 trong 2 điều kiện nghiên cứu trên cho ta thấy rằng, trong quá trình bào chế, bảo quản cần chú ý tránh để cho hoạt chất tiếp xúc với nhiêt và thâm chí là cả ẩm.
— Nếu ta tính hoạt độ enzym của AB3 theo lượng a - Chymotrypsin ban đầu C%AC= 3.33.10'^% thì HđABg = 2400 nK. Trong khi đó nếu ta lập một đồ
thị từ bảng 5, (cột c% nhân với N=1 0"^)
C(%)xN Sự thay đổi hoạt độ của AC theo C(%)
0 750 150 225 300 375 450 525 600 675 750 825 900 975 105
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00
HđAC
Hình 8; Sự thay đổi của HđAC khi thay đổi nồng độ nghiên cứu
^ Từ hình 8 , ta có thể tính được hoạt độ của a - Chymotrypsin tại c = 3,3-10'^ là HđAC = 2300nK. Qua đó có thể khẳng định rằng hoạt độ enzym của AB3 là tương đương với chế phẩm a - Chymotrypsin ban đầu.
* Tính khả thi
— Giá của 1 Kg a - Chymotrypsin (dược dụng) trên thị trường hiện này là khoảng 50 triệu đồng. Trong khi đó giá của bromelain được sản xuất trong
nước giá chỉ là 500 000/lKg. Như vậy, khi giảm được IKg a - Chymotrypsin nguyên liệu là ta đã có thể giảm được khoảng 45 triệu đồng đầu vào của sản phẩm, đồng thời tăng khả năng duy trì hoạt tính enzym của chế phẩm.
PHẨN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1 Kết luận
— Đã tạo được 3 chế phẩm bromelain (Bị, Bj, B3) từ quả dứa (Ananas comusa Bromeliaceae).
— Xác định được hoạt độ enzym của B3 và a - Chymotrypsin bằng phương pháp hoá sinh. Trong đó HđB3= 121nK, HđAC= 1500nK.
— Đã xác định được tỉ lệ phối hợp theo khối lượng để thay thế a -
Chymotrypsin bằng B3 là AC/B3=1/11
— Đã tạo được hỗn hợp AB3 theo tỉ lệ AC/B3= 1/11 (thay thế 50% AC)
có khả năng thuỷ giải protein tương tự 100% a - Chymotrypsin.
— Đánh giá được độ bền hoạt tính của hỗn hợp enzym trong một số điều kiện bảo quản sau:
+ Đặt trong chai nút kín, giữ trong tủ ấm ở 45°c, tốc độ giảm hoạt độ enzym trung bình là Vtb= 28.9nK/tuần. Sau 7 tuần nghiên cứu phần trăm hoạt độ còn lại của AB3 là HđABg^ 47.3%.
+ .Đặt trong chai nút kín, để ở điều kiện phòng thí nghiệm (t°= 30 ± 2°C), tốc độ giảm hoạt độ enzym trung bình là 12.5nK/tuần. Sau 7 tuần nghiên cứu, phần trăm hoạt độ còn lại của AB3 là HđABg = 79.8%.
— Việc sử thay thế a - Chymotrypsin bằng bromelain sản xuất trong nước có hiệu quả cao về kinh tế (cứ thay thế được IKg là giảm được 45 triệu đồng chi phí đầu vào). Như vậy rõ ràng là hướng đi này cố tính khả thi cao, nếu được ứng dụng trong sản xuất sẽ giúp làm giảm giá thành sản phẩm và tăng độ ổn định của chế phẩm.
3.2 Đề xuất
Đây mới chỉ những là nghiên cứu ban đầu, vì vậy tôi đề nghị ghiên cứu tiếp theo là:
+ Tinh chế để tạo ra chế phẩm bromelain có hoạt độ enzym cao hơn nữa.
+ Đánh giá độ bền hoạt tính của chế phẩm enzym ở các điều kiện khác nhau và ở các dạng chế phẩm khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đặng Hạnh Phúc, Lê Thị Thoa, Nguyễn Thanh Vân, Phạm Thị Chiến - Điều tra hoạt tính bromelain trong một sô' loại dứa Việt Nam -
tạp chí dược học.
2 Lê Ngọc Tú, Luu Duẩn, Đặng Thị Thu, Đặng Thị Huệ, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thuỷ - Biến hình sinh học các protein - NXB
KH & KT, Hà N ộ i, tr. 4 4 -1 1 9 .
3 Nguyễn Đức Lương, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thuỷ Tiên, Tạ
Thu Hằng, Nguyễn Thuý Hương, Phan Thị Huyền (2004) - Công nghệ
enzym - NXB ĐHQGTPHCM tr. 167-184, 282 - 287.
4 Nguyễn Hữu Chấn - Enzym và xúc tác sinh học - NXB YHHN 1996
5 Nguyễn Văn Mùi - Thực hành hoá sinh học - NXB ĐHQGHN
2001
6 Nguyễn Văn Mùi - Xác định hoạt độ enzyme - NXB KH&KT 2002, trang 85- 87.
7 Nguyễn Văn Rư, luận án tiến sĩ Dược học - Nghiên cứu tạo chê phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng trong phòng
chông suy dinh dưỡng - Hà Nội năm 2002.
8 Nguyễn Văn Rư, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Xuân Thắng (2002) - Đánh giá sự biến đổi hoạt độ protese của ch ế phẩm enzym trong quá trình bào ch ế và bảo quản - Tạp chí dược học sô 6/2002, ti: 15-18.
9 TS. Đào Kim Chi, PGS.TS. Nguyễn Xuân Thắng, DS Nguyễn Duy Thiệp (2000) - Thực tập Hoá Sinh Dược - tr. 49.
10 Bristish Pharmacopoeia (2001) Buffer solution Appendix I D A117-A122.
11 http://cn.wikipedia.org/wiki/chvmotrvpsin
13 https://www.immunesupport.coni/shop/producl cfm 14 http://nutrasanus.com /brom elain.htm l
15 http://www.nutriteck.com/bromelain.html
16 W hitaker J.R (1972) - Principle o f enzymology for the food sciencies - New York, USA.
17 www.thorne.com/altmedrev/fulltext/bromelain l-4.htm l 18 www.gianteagle.com/healthnotes/supp/bromelain.html