2. Thực nghiệm và kết quả
2.2.5. Phân lập alkaloid bằng sắc ký cộ t
Chúng tôi dùng sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagen Merck (0,063 0,2 mm) để phân lập và tinh chế alkaloid toàn phần A.
• Chuẩn bị cột sắc ký
Cột sắc ký có đường kính 2cm dài 50cm. Cột được rửa sạch, tráng bằng cồn cao độ, sấy thật khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định vững chắc, lót ở
đoạn dưới nối từ vòi lên đáy cột 1 ít bông. Cân 30g silicagen, hoạt hoá ở
1 1 0 °c trong Ih, sau đó trộn đều silicagen đã hoạt hoá vói cloroform thành một hỗn dịch. Rót từ từ hỗn dịch vào cột, mở vòi khoá cột cho dung môi chảy
để chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Dung môi hứng được đổ lên cột và cho chảy liên tục trong 2h để cột ổn định hoàn toàn.
• Đưa chất nghiên cứu vào cột
Trộn 1 lượng silicagen vừa đủ (khoảng 0,7 - Ig) để thấm hết dịch đậm đặc của Ig cắn alkaloid toàn phần rồi sấy khô. Rút dung môi trong cột xuống gần sát lớp silicagen. Cho từ từ hỗn hợp cắn và silicagen khô vào cột tạo thành một lớp đều trên cột, phủ tiếp một lượng silicagen Icm lên trên.
• Tiến hành sắc ký
Rửa giải cột ở nhiệt độ thường bằng hệ dung môi Cloroform : Methanol với tỉ lệ Methanol tăng dần [12:1]; [12:2]; [12:3] với tốc độ chảy 40 giọt trong
1 phút. Dùng ống nghiệm nhỏ hứng mỗi phân đoạn 3ml.
Kiểm tra từng phân đoạn bằng SKLM vói hệ dung môi Cloroform: Methanol [12 : 1]. Soi đèn tử ngoại và phun hiện màu bằng TT Dragendorff.
Căn cứ vào kết quả SKLM chúng tôi dồn tất cả các phân đoạn nhỏ có Rf giống nhau vào 1 ống gọi là những phân đoạn lán. Kết quả được ghi lại ở bảng 2.7.
Bảng 2.7: Các phân đoạn trong quá trình sắc ký cột lần 1 STT các phân
đoạn lớn
STT các phân đoạn nhỏ
Hệ dung môi rửa cột CHCI3 : MeOH Số vết chấm trên bản sắc ký I 1-13 1 2 : 1 2 II 14-31 1 2 : 1 2 III 32-45 1 2 : 1 2 IV 46-65 1 2 : 2 2 V 66-80 12; 3 3
Để bay hoi dung môi trong các ống nghiệm ở nhiệt độ thường chúng tôi thấy phân đoạn từ ống số 32-45 có các tinh thể kết tinh ở thành ống nghiệm. Tách dung dịch mẹ để lấy riêng các tinh thể. Sau đó tinh chế lại thu được chất Cị ở dạng tinh thể, không màu, tan trong cloroíorm, methanoL
Chúng tôi cũng nhận thấy rằng phân đoạn V gồm các ống từ 66-80 có 3 vết trên SKLM nhưng 2 vết rất mờ, 1 vết rất đậm nên chúng tôi quyết định tiếp tục tiến hành sắc ký cột lần 2 để tiếp tục tách các alkaloid.
Chúng tôi tiến hành tương tự như trên v ớ i:
+ Cột silicagen: đường kính l,5cm; cao 25cm; chứa 15g silicagen . + Chất phân tích: cắn alkaloid phân đoạn V.
+ Dung môi khai triển: CHƠ3 : MeOH [12:2]; [12:3]. + Mỗi phân đoạn hứng Iml.
Kiểm tra phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi Cloroform : Methanol [12:2]. Soi đèn tử ngoại và phun hiện màu bằng TT Dragendorff.
Căn cứ vào kết quả SKLM chúng tôi dồn tất cả các phân đoạn nhỏ có Rf giống nhau vào 1 ống gọi là những phân đoạn lớn. Kết quả được ghi ở bảng
2.8.
Bảng 2.8 : Các phân đoạn trong sắc ký cột lần 2 STT các phân
đoạn lớn
STT các phân đoạn nhỏ
Hệ dung môi rửa CHCI3 : MeOH Số vết chấm trên bản sắc ký I 1 -1 0 1 2 : 2 2 II 11-17 1 2 : 2 2 III 18-30 12 : 3 1
Cũng để bay hơi ở nhiệt độ thường, sau 1 thời gian thấy phân đoạn III gồm các ống từ 18 - 30 có các tinh thể hình kim bám ở thành ống nghiệm. Tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được chất C2ở
dạng tinh thể không màu, tan tốt trong methanol. > Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập
- Kiểm tra độ tinh khiết của chất Cj bằng SKLM một chiều với 3 hệ dung môi:
H ệl; CHCl3;M e O H [1 2:l]
Hệ II: CHCI3, MeOH : NH4OH [50 : 9 : 1] Hệ III: BuOH : CH3COOH : H2O [5 ; 1 : 4]
TT hiện màu là Dragendorff.
Kết quả SKLM vói 3 hệ dung môi được trình bày ở bảng 2.9 và hình 2.5. Bảng 2.9 : Giá trị Rf và màu sắc vết phân lập được
trong lá Crỉnum SP7.
Hệ Rf Màu sắc Sau khỉ phun TT
Ánh sáng thường uv Màu uv
H ệl 0,33 Không màu Tứĩi Đỏ gạch Túnđen
HệH 0,70 Không màu Tím Vàng cam Tửnđen
Hệ III 0,49 Không màu Tím Vàng cam Tứnđen
Nhận xét: Sau khi tiến hành SKLM một chiều với 3 hệ dung môi trên, chúng tôi thấy chất Cj phân lập được chỉ xuất hiện 1 vết. Điều đó chứng tỏ Ci là đơn chất.
- Kiểm ưa độ tinh khiết của chất C2 bằng SKLM một chiều vói 3 hệ dung môi.
o Hệl: CHa3:MeOH[12:l]
o Hệ II: Cloroform: Aceton: Methanol: Amoniac đặc [20:20:3:1]
o Hệ IH: MeOH : NH4 0 H^e [10: 0,05] Thuốc thử TT hiện màu là Dragendorff.
Sau khi chấm chất C2 lên bản mỏng silicagen G F 2 5 4 đã ữáng sẵn và khai triển vói 3 hệ dung môi ttên, phun thuốc thử chỉ thấy xuất hiện một vết màu đỏ gạch, điều đó chứng tỏ C2 là đơn chất. Kết quả SKLM với 3 hệ dung môi được ttình bày ở bảng 2 . 1 0 và hình 2 .6 .
Bảng 2.10 : Giá trị Rf và màu sắc vết C2 phân lập được trong lá Crỉnum SP7
Hệ Rf Màu sắc Sau khi phun TT
Ánh sáng thường uv Màu uv
H ê l 0 , 2 Không màu Tím Đỏ gạch Túnđen
Hê II 0 , 2 1 Không màu Tím Vàng cam Túnđen
Hêin 0,17 Khổngmàu Tím Vànscam Túnđen