Rong câu chỉ vàng được thu vào tháng 6/2013 tại biển Hải Phòng. Mẫu được định tên khoa học bởi TS. Đàm Đức Tiến – Viện Tài nguyên và Môi trường biển. Tiêu bản được lưu trữ tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.2.1. Dụng cụ - Phễu chiết. - Bình tam giác 1000 ml, 500 ml. - Bình cô quay.
- Ống nghiệm đường kính 2-3cm, chiều cao 6cm. - Bản mỏng, bình triển khai.
- Các dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm.
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy sắc ký GC FINNIGAN Trace GC ultra – Gemany - Máy cô quay chân không EYELA N-1200A
- Máy ly tâm MIKRO 220R Hettich- Zentrifugen - Máy siêu âm.
- Cân phân tích XT 220A Precisa. - Thiết bị nấu, lọc agar.
- Hệ thống bảo quản mẫu.
Hình 4: Máy sắc kí khí GC Hình 5: Máy cô quay chân không
Hình 6: Máy ly tâm Hình 7: Cân phân tích
2.2.3. Hóa chất
- Dung môi: CH3OH, CH3Cl, C6H14...
- Na2SO4, CH3ONa, NaOH 5%, 10%, 15%, H2SO4...
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xác định hàm lượng nước, hàm lượng tro tổng số, các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng
•Hàm lượng nước
Thực nghiệm: Cân m0 gam mẫu rong tươi rồi đưa vào đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ 100- 110°C, cứ khoảng 5 giờ lại đem cân đến khi khối lượng không
đổi, cân và ghi lại khối lượng rong khô thu được. Hàm lượng nước của mẫu rong được tính theo công thức sau:
%H2O = x 100%
Trong đó: m0 là khối lượng rong tươi trước khi sấy m là khối lượng rong khô sau khi sấy.
•Xác định hàm lượng tro tổng số
Thực nghiệm: Cân 20 gam mẫu rong đã được xử lý vào cốc nung bằng sứ và đặt trong lò nung, nâng dần nhiệt độ lên 525 °C. Giữ nhiệt độ đó trong 2 giờ. Chuyển thẳng cốc nung vào bình hút ẩm, để nguội, cân ngay và xác định hàm lượng tro tổng số bằng công thức sau:
% Hàm lượng tro = x 100%
Trong đó: m khối lượng cốc và rong sau nung mo khối lượng cốc trước khi nung M: khối lượng rong ban đầu.
•Xác định các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng
Việc xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng được thực hiện bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cùng các bộ phận đi kèm: Thermo Elemental – Model Solaar M6 Dual Zeeman Atomic Aborption Spectrometer đi cùng hệ tạo hydrua VP 90- hydide generation, đèn catot rỗng, HCL data Coded. Xác định các nguyên tố vi lượng được thực hiện tại phòng Khoa học và Kỹ thuật phân tích – Viện Hóa học.
Thực nghiệm: Cân 0,5 gam mẫu rong khô vào trong bình phá mẫu dung tích 55 ml đưa vào đó 5ml axit nitric, đậy nắp lại và vặn chặt. Đưa vào lò vi sóng và chạy với nhiệt độ ở 200°C trong thời gian 30 phút.
Sau khi phá mẫu, mẫu được đưa về định mức 50 ml bằng nước cất 2 lần, mẫu được pha loãng từ 5 đến 10 lần bằng dung dịch axit nitric 20%.
Mẫu được chuyển vào máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử và xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng.
Theo phương pháp của Bligh và Dyer, 1959 [21]. Phương pháp đã được chuẩn hóa phù hợp điều kiện Việt Nam tại phòng Hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Thực nghiệm: Cân 100 gam mẫu rong tươi, nghiền nhỏ trong máy xay, chiết bằng hệ dung môi CHCl3: CH3OH tỷ lệ 1:2 (100ml CH3Cl : 200ml CH3OH), siêu âm 6h. Bổ sung 100ml CHCl3, thêm 80ml nước cất, lắc đều, phân lớp lấy phần dịch ở phía dưới , rửa bằng nước cất hai lần, sau đó làm khan bằng Na2SO4. Dịch chiết được cô quay loại dung môi chân không trên máy quay cất chân không ở 40°C, áp suất 25 tor thu được lipit tổng. Lượng lipit tổng được cân trên cân phân tích Sartorius analytic (0,0001) và tính hàm lượng phần trăm theo công thức:
H (%)= (%)
Trong đó: H (%) là hàm lượng lipit tổng có trong rong M là khối lượng rong ban đầu đem chiết m là khối lượng lipit tổng thu được.
2.3.3. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo có trong lipit tổng
Theo tiêu chuẩn ISO/DIS 659:1998, LB Đức [24].
Thực nghiệm: 10mg lipit tổng được hòa tan với 1ml n-hexan trong lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25ml dung dịch CH3ONa 30% và lắc kỹ trong 1 phút. Thêm vào 20mg Na2SO4 loại sạch, lắc kỹ và đem ly tâm ở chế độ 5000v/phút trong 1phút. Dịch trong, sạch ở pha trên được tách riêng, kiểm tra trên sắc ký bản mỏng (TLC) rồi đem phân tích trên máy sắc ký khí GC (HP-6890). Cột mao quản: HP-Innowax (30m x 0,25mm, df 0.25μm), khí mang He, chạy theo chương trình nhiệt độ: 200oC trong 10 phút, tăng nhiệt độ từ 200-230oC trong thời gian 5 phút, giữ ở nhiệt độ 230oC trong 10 phút. Nhận dạng axit béo bằng phần mềm chuyên dụng tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ELC (Equivalent Chain- lengths of methyl ester derivaties of fatty axits) sử dụng hệ chất chuẩn là C16:0, C18:0.
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar chất lượng agar
Nồng độ kiềm để chiết agar được khảo sát là 5%, 10%, 15%. - Ảnh hưởng của thời gian ngâm kiềm
Thời gian ngâm kiểm được khảo sát ở 3, 5, 7 ngày.
Các thí nghiệm này được tiến hành đối với 02 mẫu là mẫu rong đã qua chiết lipit tổng và mẫu rong chưa chiết lipit để so sánh. Mẫu agar của Việt Nam (agar loại 1 của nhà máy đồ hộp Hạ Long) được sử dụng để làm mẫu đối chứng.
2.3.5. Kiểm tra chất lượng agar
2.3.5.1. Xác định nồng độ gel : theo quy chuẩn Việt Nam số QCVN 4 – 21: 2011/ BYT của Bộ Y tế[13].
Thực nghiệm: Pha các dung dịch mẫu thử agar với hàm lượng 0,2%, 0,25%...cho vào các ống nghiệm có đường kính 16mm, chiều dài 150mm. Nút ống nghiệm và làm mát ở nhiệt độ 20-25°C trong 1 giờ. Đổ cột gel từ các ống nghiệm lên trên một mặt phẳng. Nồng độ thấp nhất chịu được áp lực trong 5- 30 giây mà không bị gãy vỡ là nồng độ gel của agar cần xác định.
2.3.5.2. Xác định nhiệt độ đông:
Thực nghiệm: Cho 10 ml dịch agar (1%) hòa tan hoàn toàn bằng nước ở nhiệt độ 100 °C và một viên bi thủy tinh đường kính 5mm vào ống nghiệm đường kính 2,3cm, cao 6cm. Ống nghiệm này được quay lên và xuống ở nhiệt độ phòng cho đến khi viên bi ngừng chuyển động. Đo nhiệt độ tại thời điểm đó. Nhiệt độ đo được là nhiệt độ đông của agar.
2.3.5.3. Xác định nhiệt độ tan đông của agar:
Thực nghiệm: Cho 10 ml dịch agar (1%) hòa tan hoàn toàn bằng nước ở nhiệt độ 100°C ống nghiệm đường kính 2,3cm, cao 6cm. Sau đó, nút ống nghiệm và làm mát ở nhiệt độ 20 – 25°C trong một giờ. Đặt lên bề mặt gel một viên bi thủy tinh. Cho ống nghiệm vào bể ổn nhiệt và tăng dần nhiệt độ từ 20 – 100°C. Quan sát và đo nhiệt độ tại thời điểm viên bi chìm xuống đáy ống nghiệm. Nhiệt độ đo được tại thời điểm đó là nhiệt độ tan đông của agar.
Thực nghiệm: cân 1 - 2 gam rong sau khi chiết lipit tổng, đun ở 100°C, thu hơi, phân tích hơi sinh ra trên máy sắc kí khí GC-MS.
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lượng tro, nước, các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng trong rong trong rong
Kết quả phân tích hàm lượng tro, nước và các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng thể hiện ở bảng 2:
Bảng 2: Hàm lượng tro, nước và các nguyên tố vi lượng
Tro (%) Các nguyên tố vi lượng (mg/kg) Kim loại nặng (mg/kg) H20 (%) I2 Fe Cu Zn Mn Pb Cd As 1,42 30,74 7233,65 8,70 52,60 7179,71 5,321 0,789 4.02 81,55
Kết quả phân tích cho thấy rong câu chỉ vàng có hàm lượng tro tổng số là 1,42%. Hàm lượng nước của rong là 81,55%.
Rong câu chỉ vàng có hàm lượng các nguyên tố vi lượng rất cao đặc biệt là sắt (Fe) 7233,65 ppm/kg, mangan (Mn) 7179,71 ppm/kg, kẽm (Zn) 52,6 ppm/kg, iot (I2) 30,74 mg/kg, đồng (Cu) 8,7 ppm/kg. Các nguyên tố vi lượng này rất cần thiết cho cơ thể sống.
Ngoài các nguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể sống như đã nêu ở trên, chúng tôi cũng nhận thấy có hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng như chì (Pb) 5,321 ppm/kg, Cadmi (Cd) 0,789 ppm/kg, Asen (As) 4,02 ppm/kg không cao và đạt tiêu chuẩn an toàn theo TCVN. Điều này là do rong có khả năng hấp thụ rất cao các nguyên tố có trong môi trường nước biển vì vậy chúng tôi nhận thấy việc kiểm soát kim loại nặng trong rong nguyên liệu khi tiến hành sản xuất công nghiệp là vô cùng quan trọng.
3.2. Hàm lượng lipit tổng
Lượng lipit tổng được xác định theo phương pháp nêu ở mục 2.4.2. sau khi chiết rong và cô quay loại bỏ dung môi thu được là 0,233g. Hàm lượng lipit tổng là: H (%)= x 100% = 0,233% so với khối lượng tươi.
Rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata có hàm lượng lipit tổng thấp tuy nhiên giá trị lipit tổng của nó được thể hiện qua các chỉ số axit béo đặc biệt là các axit béo không no không có trong các loài thực vật trên cạn.
3.3. Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng
Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng của rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata được thể hiện trong bảng 3 và hình 9, 10:
Bảng 3: Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng
TT Tên của axit béo Tên khoa học Tên thông thường lưu (phút)Thời gian lượng (%)Hàm
1 13:0 Tridecanoic axit - 3.65 0.43 2 14:0 Tetradecanoic axit Myristic 4.27 4.31 3 15:0 Pentadecanoic axit - 4.9 0.28 4 16:0 Hexadecanoic axit Palmitic 5.95 45.5
5 16:1n-9 7-cis-hexadecenoic axit - 6.27 1.65
6 Phytanic 3,7,11,15-tetramethyl hexadecanoic axit - 7.24 0.94
7 18:0 Octadecanoic axit Stearic 9.02 2.26 8 18:1n-7 cis-9-octadecenoic axit - 9.41 9.79 9 18:1n-9 cis-7-octadecenoic axit Oleic 9.65 1.97
10 19:5n-3 cisnonadecenoic axit-7,10,13,16,19- - 18.66 3.43
11 20:4n-6 ciseicosatetraenoic axit-5,8,11,14- AA 20.81 18.04
12 20:4n-3 ciseicosatetraenoic axit-6,9,12,15,- - 23.26 1.96
13 20:5n-3 ciseicosapentaenoic axit-7,10,13,16,19- EPA 24.83 2.86
14 21:4n-3 cisdocosatetraenoic-6,9,12,15,- - 30.10 0.35
Tổng axit béo no 53.72
Tổng axit béo không no 40.05
Hình 9: Tỷ lệ các axit béo trong rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata
Hình 10: Hàm lượng các axit béo.
Kết quả phân tích thành phần và hàm lượng các axit béo trong rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata cho thấy dịch chiết lipit tổng rất phong phú về thành phần các axit béo no và không no có mạch cacbon từ C13 đến C21 (bảng 3). Hàm lượng các axit béo no (hình 9) đạt 53,72% chủ yếu là các axit béo C14:0 (4.31 %), C16:0 (45.5 %), C18:0 (2.26 %), trong đó hàm lượng axit palmitic (C16:0) chiếm hàm lượng cao nhất (hình 10). Đây là chất được ứng dụng nhiều trong việc làm phụ gia trong công nghiệp, dược phẩm, mỹ phẩm và đóng gói thực phẩm...
Trong các axit béo không no chúng tôi đặc biệt chú ý đến hàm lượng các axit béo thiết yếu thuộc họ omega3 (n-3) và họ omega6 (n-6) vì đây là các axit béo mà các loài động vật không tự tổng hợp mà phải bổ sung vào cơ thể
bằng nguồn thức ăn. Đặc biệt ở rong biển có mặt các axit béo mạch dài C20, C21 trong đó có EPA là axit béo rất hiếm thấy ở các sinh vật trên cạn.
Theo nghiên cứu này chỉ ra, trong lipit của rong câu chỉ vàng có chứa 22,86% hàm lượng cao các axit béo không no họ eicosanoit: axit arachidonic 20:4n-6 (AA)18,04 %, eicosapentaenoic 20:5n-3 (EPA) 2,86 %, 20:4n-3 (1,96%). Đây là những axit béo rất quan trong trong sự sống, vì thiếu chúng cơ thể sẽ mất cân bằng gây ra các bệnh tim mạch, viêm nhiễm. Các axit béo họ eicosanoit là tiền chất để tổng hợp lên prostaglandin nhờ enzyme nội sinh.
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar
Lô TN
Thời
gian Ký hiệu 0 Nồng độ đông gel của agar (%)
0.2 0 0.25 0 0.3 0 0.35 0 0.4 0 0.45 0 0.5 0 0.55 0 0.6 0 0.65 0 0.7 ĐC Agar VN - - - + + + + + + + + Mẫu rong đã chiết lipit tổng 3 ngày DM3 (5%) - - - - - - + + + + + DM3 (10%) - - - - - + + + + + + DM3 (15%) - - - - - - + + + + + 5 ngày DM5 (5%) - - - + + + + + + + + DM5 (10%) - - - - + + + + + + + DM5 (15%) - - - - - - + + + + + 7 ngày DM7 (5%) - - - - - - + + + + + DM7 (10%) - - - - - - + + + + + DM7 (15%) - - - - - + + + + + + Mẫu rong chưa chiết lipit 3 ngày KDM3 (5%) - - - - - - + + + + + KDM3 (10%) - - - - + + + + + + + KDM3 (15%) - - - + + + + + + + + 5 ngày KDM5 (5%) - - - - - + + + + + + KDM5 (10%) - - - + + + + + + + + KDM5 (15%) - - - - - + + + + + + 7 ngày KDM7 (5%) - - - - - - + + + + + KDM7 (10%) - - - - + + + + + + + KDM7 (15%) - - - - - + + + + + +
Kết quả nghiên cứu cho thấy rong đã qua chiết lipit tổng có khả năng đông gel tương tự như mẫu rong chưa chiết lipit. Tuy nhiên, rong đã qua chiết
lipit cần lượng kiềm xử lý ít hơn, với nồng độ kiềm 5% trong 5 ngày khả năng đông gel của agar thành phẩm tương đương với agar thu được từ mẫu rong chưa chiết lipit với nồng độ kiềm sử dụng là 15% trong 3 ngày hoặc 10% trong 5 ngày. Vì vậy chúng tôi lựa chọn xử lý kiềm ở nồng độ 5% trong 5 ngày với rong đã qua chiết lipit để tiến hành chiết agar.
3.5. Kết quả xác định hiệu suất thu agar và một số đặc điểm lý hóa và tồn dư dung môi của sản phẩm agar dư dung môi của sản phẩm agar
Kết quả xác định hiệu suất và các đặc tính lý hoá của agar được trình bầy ở bảng 5:
Bảng 5: Hiệu suất thu agar và đặc tính lý hóa của agar
STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Mẫu rong chưa chiết lipit Mẫu rong sau khi chiết lipit
1 Hiệu suất agar % 18 15,8 2 Sức đông g/cm2 550 550 3 Nhiệt độ đông ° C 39,5 ± 0,5 38,5 ± 0,5 4 Nhiệt độ tan đông ° C 87,5 ± 0,5 87,5 ± 0,5 5 Nồng độ gel % 0,35 0,35
Kết quả phân tích ở bảng 5 cho thấy hiệu suất thu agar của rong câu đã qua chiết lipit giảm 2,2% so với rong sau thu hoạch, hiệu suất đạt tương ứng là 15,8% và 18% so với lượng rong ban đầu.
Các chỉ tiêu lý hóa như sức đông, nhiệt độ tan đông của hai mẫu agar thu được từ rong tươi chưa chiết lipit so với rong đã chiết lipit không có sự sai khác hoặc sai khác không đáng kể. Sức đông đạt 550g/cm2, nhiệt độ tan đông là 87,50C, nồng độ tạo gel là 0,35% và nhiệt độ đông gel là 38,5%.
Mẫu agar đun với nước thu phần hơi sau đó đem phân tích trên máy GC-MS. Kết quả xác định dung môi dư qua phổ GC-MS ở hình 11 cho thấy agar thành phẩm sử dụng nguyên liệu rong câu đã qua quá trình chiết lipit tổng không còn dư lượng dung môi đã sử dụng.
Hình 11: Phổ GC-MS kiểm tra dư lượng dung môi của agar.
3.6. Quy trình kép thu nhận lipit chứa các axit béo họ eicosanoit và agar từ nguyên liệu rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata từ nguyên liệu rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata
Từ các kết quả đã nghiên cứu ở trên, chúng tôi đưa ra quy trình kép thu nhận lipit tổng và agar gồm 4 bước cơ bản sau:
• Bước 1: Chiết lipit tổng
Mẫu rong sau thu hoạch được rửa sạch, để ráo nước, chiết lipit tổng bằng dung môi hữu cơ. Sau đó, phơi khô bã rong và xử lý kiềm.
• Bước 2: Xử lý kiềm và tẩy trắng
Ngâm kiềm ở nồng độ 5% và thời gian ngâm là 5 ngày. Trung hoà về pH = 7. Tẩy trắng nguyên liệu bằng nước gia-ven 2-5% trong 15 phút.
• Bước 3: Chiết agar
Bổ sung nước và nấu agar ở nhiệt độ 100oC trong 2 giờ. Lọc nóng sau đó làm lạnh, để tan đông hoặc ép thu agar.