3.2.2.1. Thời điểm nở trong ngày của miracidium
Biết được chính xác thời điểm nở trong ngày của miracidium rất quan trọng trong nghiên cứu sinh học của sán lá gan, giúp cho việc thu miracidium để gây nhiễm cho ốc vào thời điểm thích hợp nhất. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công bố nào về đặc điểm này. Để theo dõi thời điểm nở trong ngày của miracidium, chúng tôi nuôi trứng sán lá gan trong đĩa petri, nhiệt độ phòng dao động 26-28oC (mùa thu đông), sắp đến ngày trứng nở để đĩa trứng
35
ra gần cửa sổ có ánh sáng. Đếm số lượng miracidium nở ở từng thời điểm trước 6h, 6-7h, 7-8h, 8-9h, 9-10h, 10-11h, 11-12h và đến chiều tối. Kết quả cho thấy không có trứng nào nở trước 6h, trứng sán nở từ sau 6h đến 10h sáng, sau 10h sáng đến chiều không có trứng nở. Tính tỷ lệ trứng nở trung bình ở các thời điểm cho thấy 31,2% trứng nở từ 6-7h, sau đó số trứng nở tăng lên 39,8% ở thời điểm 7-8h, và giảm xuống 20,9% ở 8-9h và 8,0% từ 9- 10h (bảng 3.7). Như vậy, trứng sán nở tập trung nhất vào lúc 6-8h, tương đương với thời điểm mặt trời đã lên và chiếu sáng làm nhiệt độ môi trường ấm lên, cũng là lúc ốc vật chủ trung gian hoạt động mạnh nhất. Ốc Lymnaea thường hoạt động vào buổi sáng sớm, khi mặt trời lên cao và nhiệt độ môi trường nóng lên vào buổi trưa thì ốc thường tìm nơi ẩn náu hoặc chui xuống bùn. Đặc điểm chọn thời điểm nở vào buổi sáng của miracidium có thể là đặc điểm tiến hóa của sán phù hợp với đặc tính sinh học của ốc vật chủ trung gian để ấu trùng sán có cơ hội tiếp xúc với vật chủ trung gian nhiều nhất. Kết quả nghiên cứu này cũng khuyên rằng để có ấu trùng miracidium gây nhiễm thực nghiệm cho ốc, nên thu miracidium vào buổi sáng, khoảng từ 6-8h để được số lượng miracidium tập trung nhất.
Bảng 3.7. Thời điểm trứng sán nở trong ngày
Thời điểm Số trứng nở (%) ở các thời điểm khác nhau ở
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Trung bình
Trước 6h 0 0 0 0 6-7h 30 (31,6) 28 (30,4) 18 (31,6) 31,2 7-8h 38 (40,0) 36 (39,1) 23 (40,4) 39,8 8-9h 19 (20,0) 20 (21,7) 12 (21,1) 20,9 9-10h 8 (8,4) 8 (8,7) 4 (7,0) 8,0 Sau 10h 0 0 0 0 Tổng 95 92 57 0
36
3.2.2.2.Đặc điểm bơi và thời gian sống của miracidium
Quan sát miracidium cho thấy sau khi nở từ trứng, miracidium hoạt động rất mạnh ở đáy nước. Miracidium bơi rất nhanh, thường bơi thẳng về phía trước rồi quay ngược lại, ít khi miracidium bơi từ dưới lên trên.Sau một thời gian yếu dần, miracidium bơi với tốc độ chậm lại, và cuối cùng là bơi quay tròn, rồi chết.
Theo dõi thời gian sống của miracidium ở điều kiện 26-28oC cho thấy miracidium sống được từ 10-12h. Trước 10h sau khi nở chưa có miracidium chết, sau 10h tỷ lệ chết là 7,8%, từ 10-11h tỷ lệ chết là 40,0% và từ 11-12h tỷ lệ chết là 52,2% (bảng 3.8).
Đặc điểm bơi của miracidium rất quan trọng, đã được sử dụng để xác định khả năng của chúng nhiễm vào ốc.Ginetsinskaya (1988) đã xác định tốc độ bơi của miracidium là 1.3-2.5 mm/giây.Nếu miracidium mất khoảng 30 giây để di chuyển 1cm thì không có khả năng nhiễm vào ốc, trong khi miracidium chỉ cần 4-12 giây thì thường nhiễm được cho ốc. Những miracidium bơi tròn thì không có khả năng nhiễm vào ốc nữa (Boray 1969).
Bảng 3.8. Khả năng sống của miracidium ở điều kiện 26-28oC
Thời gian sau nở
Tỷ lệ % miracidium chết ở các thời điểm khác nhau
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Trước 10h 0 0 0 0 10h 2 (6,7) 3 (10,0) 2 (6,7) 7,8 11h 12 (40,0) 10 (33,3) 14 (46,7) 40,0 12h 16 (53,3) 17 (56,7) 14 (46,7) 52,2 Tổng 30 (100) 30 (100) 30 (100) 100
Tìm kiếm vật chủ ốc thích hợp để xâm nhập rất là quan trọng đối với sự tồn tại của sán. Khả năng xâm nhập vào ốc được phát triển theo thời gian của
37
miracidium. Miracidium chưa có khả năng xâm nhập vào ốc trong vài phút đầu sau khi nở, khả năng xâm nhập tốt nhất là sau 1.5-2.0 h sau khi nở và sau đó giảm dần (Ginetsinskaya 1988). Nếu miracidium không tìm kiếm được vật chủ ốc thì thường chết trong vòng 24h (Thomas 1883a,b; Hope-Cawdery et al. 1978). Tỷ lệ miracidium chết phụ thuộc vào nhiệt độ và tuổi: thời gian sống của miracidium giảm từ 36h ở 6°C xuống chỉ còn 6h ở 25°C. Ở 10°C thời gian sống khoảng 1 ngày (Dalton 1999). Ở 8, 16 và 24°C khả năng tìm kiếm vật chủ ngừng sau 24–30, 20–24, và 13–20h, tương ứng (Christensen et al.1976). Tỷ lệ chết phụ thuộc vào tuổi là đặc điểm phổ biến ở những giai đoạn ấu trùng không dinh dưỡng, có đời sống ngắn và liên quan đến nguồn năng lượng dự trữ (Anderson et al.1982).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, miracidium sống được 10-12h ở điều kiện 26-28oC, kết hợp với thời điểm nở của trứng sán từ 6-10h sáng, khuyên rằng trong gây nhiễm thực nghiệm ấu trùng sán lá gan cho ốc nên gây nhiễm vào buổi sáng từ 6h để có tỷ lệ thành công cao hơn.
3.2.2.3. Độ sâu ưa thích của miracidium
Trong quá trình quan sát hoạt động của miracidium, chúng tôi thấy rằng miracidium của sán lá gan F. gigantica thường bơi ở đáy nước, ít khi bơi lên trên bề mặt. Để xác định độ sâu ưa thích của miracidium, chúng tôi đếm 100 miracidium hút vào cốc thủy tinh có độ cao 5cm, sau đó dùng pipet hút nước từ trên bề mặtxuống, với mỗi khoảng cách 1cm cho vào một đĩa petri để đếm số miracidium ở các độ sâu 5, 4, 3, 2 và 1cm tính từ đáy nước. Kết quả cho thấy không có miracidium nào ở mặt nước đến 3cm cách đáy nước. Miracidium chủ yếu ở độ sâu 1cm tính từ đáy, chiếm tỷ lệ 91,7%, chỉ có 8,3% số miracidium ở độ sâu 2cm tính từ đáy nước (Bảng 3.9).
38
Bảng 3.9. Độ sâu ƣa thích của miracidium
Lần TN Tổng số
miracidium
Số miracidium (%) ở độ sâu tính từ đáy
5cm 4cm 3cm 2cm 1cm
Lần 1 100 0 0 0 5 (5,0) 95 (95,0)
Lần 2 100 0 0 0 12 (12,0) 88 (88,0)
Lần 3 100 0 0 0 8 (8,0) 92 (92,0)
Trung bình 0 0 0 25 (8,3) 275 (91,7)
Nghiên cứu về môi trường sống ưa thích của miracidium rất thú vị, giải thích sự tiến hóa của sán lá gan với vật chủ trung gian ốc thích hợp.Với loài sán lá gan F. hepatica, miracidium rất ưa ánh sáng, thích nghi với môi trường sống của ốc. Vật chủ trung gian của loài F. hepaticathường là ốc L. (Galba) truncatula. Môi trường sống của chúng đặc trưng là dọc theo bờ của ao nhỏ, mương, đầm lầy ở những khu vực mà có sự thay đổi khô cạn và ngập nước. Khả năng của miracidium di chuyển về phía ánh sáng đảm bảo chắc rằng nó không lãng phí nguồn năng lượng quan trọng để tìm kiếm ở đáy ao nơikhông có ốc L. (Galba) truncatula (Mas-Coma et al. 2009). Trái lại, miracidium của loài F. gigantica nhiễm vào loài ốc khác. Ở châu Phi, nơi mà F. gigantica chủ yếu nhiễm vào loài ốc L. natalensis (một loài sống ở nước sâu hơn), miracidium chủ động rời xa ánh sáng và vì thế bơi xuống vùng nước sâu hơn, nơi mà ốc thường tìm thấy (Taylor 1964).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy miracidium của loài F. giganticaở Việt Nam cũng ưa thích sống ở đáy nước, chúng chủ yếu bơi ở nền đáy, chứng tỏ miracidium tìm kiếm vật chủ ốc sống ở đáy nước, và như vậy loài ốc sống ở bề mặt vùng nước lớn sẽ ít bị nhiễm hơn. Hiểu biết đặc điểm này rất có ý nghĩa trong gây nhiễm ấu trùng sán F. gigantica cho ốc, cần phải gây nhiễm cho ốc trong đĩa petri có độ sâu khoảng 1-2cm, nếu gây nhiễm ở bình lớn hơn ốc nổi lên trên bề mặt thì cơ hội bị nhiễm sẽ thấp hơn hoặc không bị nhiễm.
39
3.2.2.4. Sự phát triển của ấu trùng sán lá gan lớn trong vật chủ trung gian
3.2.2.4.1. Tính mẫn cảm của ốc với ấu trùng sán lá gan F. gigantica
Trước đây, ở Việt Nam có 2 loài ốc thuộc giống Lymnaeađược định loại làL. viridisQuoy et Gaimard, 1832 và L. swinhoeiAdams, 1866. Gần đây, Phạm Ngọc Doanh và cs. (2012) phát hiện thêm một dạng mới nhưng chưa định loại đến loài và để ở dạng Lymnaea sp. Dung et al. (2013) dùng kỹ thuật phân tử để định loại ốc Lymnaea ở Việt Nam đã xác định loàiL. viridisở Việt Nam là synonym của loài Austropeplea viridis(Quoy & Gaimard, 1832), loài
L. swinhoei là synonym của loài Radix auricularia Linnaeus, 1758 (một số tác giả xếp là phân loài Radix auricularia swinhoei, hoặc loài Radix swinhoei), còn loài ốc mới được định loài làRadix rubiginosa(Michelin, 1831)
(hình 3.8).
Hình 3.8. Ba loài ốc Lymnaea ở Việt Nam
Trong nghiên cứu này, chúng tôi gây nhiễm miracidium của sán lá gan F. giganticacho 2 loài ốc phổ biến là A. viridis (=L. viridis) và R. auricularia
40
(=L. swinhoei) với mật độ 5 miracidium/ốc trong các đĩa petri với các điều kiện như nhau, kết quả trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả gây nhiễm miracidium sán lá gan cho các loài ốc
Loài ốc Kích thước (mm) Số ốc gây nhiễm Số nhiễm (%) Austropeplea viridis (=L. viridis) 5 100 80 (80,0) Radix auricularia (=L. swinhoei) <5 100 0 5-10 100 0 >10 100 0
Kết quả bảng 3.10 cho thấy loài ốc R. auriculariakhông bị nhiễm ấu trùng sán lá gan F. gigantica ở bất kỳ kích thước nào, chỉ loài ốc A. viridis (= L. viridis)
bị nhiễm với tỷ lệ cao 80%.
Như đã thảo luận, vật chủ trung gian của F. gigantica rất đa dạng, không dễ dàng phân biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái của chúng từ các dòng/phân loài của loài L. (Radix) auricularia.Ốc L. auricularia được xác định đóng vai trò vật chủ trung gian quan trọng của loài F. gigantica, tuy nhiên ở các vùng địa lý khác nhau là các dòng hoặc phân loài khác nhau(Kendall 1954).Ngoài ra, một số loài ốc khác cũng bị nhiễm F. gigantica. Nghiên cứu phòng thí nghiệm, Boray (1965) gây nhiễm thành công F. gigantica cho ốc L. stagnalisnon, L. pergera 4-6 tuần tuổi, L. auricularia,L. tomentosa vàL. palustris trưởng thành.Ngược lại, Guralp et al. (1964) không thành công khi gây nhiễm miracidium của F. gigantica cho ốc L. pergera hoặc L. palustris. Ở Nepal, Morel và Mahato (1987) kết luận rằng ốcL. a. rufescens và L. luteola
(L. viridis) là vật chủ trung gian của F. gigantica; ở Ai Cập, ngoài L. a. natalensis, ốc Biomphilaria alexandrina cũng bị nhiễm ấu trùng F. gigantica(Farag HF. and El-Sayad MH., 1995). Ốc L. tomentosa và L. truncatula cũng bị nhiễm F.gigantica khi gây nhiễm trong phòng thí nghiệm
41
(Dreyfuss và Rondelaud 1997).Ngược lại, Kendall (1954) và Guralp et al. (1964) không thành công trong việc gây nhiễm F. gigantica cho ốcL. truncatula ở Pakistan và Turkey. Sự khác nhau này có thể do sự khác biệt giữa các chủng F. gigantica và ốc làm thay đổi quan hệ vật chủ- vật ký sinh.
Ở Việt Nam, trước đây đã có một số công bố về vật chủ trung gian tự nhiên của sán lá gan; tuy nhiên, có sự khác nhau giữa các công bố về loài ốc vật chủ trung gian. Một số tác giả thông báo cả 2 loài ốc L. viridis và L. swinhoeiđều bị nhiễm ấu trùng sán lá gan F. gigantica (Phan Địch Lân 1985; Nguyễn Trọng Kim và Phạm Ngọc Vĩnh 1997; Nguyễn Trọng Kim 1997; Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương 1987; Nguyen et al. 2012; Phạm Diệu Thùy và cs. 2014). Một số tác giả chỉ tìm thấy cercaria của sán lá gan ở ốcL. swinhoei (Vũ Sĩ Nhàn và cs.1989; Đỗ Đức Ngái và cs. 2006).Trong khi đó, một số tác giả công bố chỉ có ốc L. viridisbị nhiễm ấu trùng sán lá gan (Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê 2005; Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et al. 2013). Sự khác nhau về vật chủ trung gian của sán lá gan ở Việt Nam có thể do sự nhầm lẫn trong việc định loại ốc, vì ốc non của 2 loài này rất khó phân biệt nếu không phải là chuyên gia định loại ốc. Cũng có thể do nhầm lẫn trong định loại ấu trùng sán lá gan (Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê 2005; Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et al. 2013).
Kết quả gây nhiễm thực nghiệm ấu trùng sán lá gan cho các loài ốc trong nghiên cứu này đã khẳng định chính xác mức độ mẫn cảm cũng như vai trò truyền bệnh sán lá gan của các loài ốc, phù hợp với nhận định của Phạm Ngọc Doanh và cs (2012) rằng chỉ có ốc L. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan, còn ốc L. swinhoei không bị nhiễm. Kết quả định loài bằng phân tử của Dung et al. (2003) đã xác định 2 loài ốc này thuộc 2 giống khác nhau, Austropeplea và
Radix, góp phần giải thích sự khác biệt về tính mẫn cảm của chúng với miracidium của sán lá gan. Hơn nữa, loàiốc mới phát hiện ở Việt Nam cũng thuộc giống Radix, và loài này ngoài tự nhiên cũng không bị nhiễm ấu trùng
42
sán lá gan (Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et al. 2013).Chứng tỏ ốc thuộc giống Raddix (R. auricularia và R. rubiginosa) không thích hợp cho sán lá gan F. giganticaở Việt Nam.
Mặc dù, một số loài ốc thuộc giống Radix được xác định đóng vai trò quan trọng trong vòng đời của F. gigantica ở châu Phi, nhưng ở Thái Lan thì vài trò truyền sán lá gan quan trọng nhất là loài ốcA. viridis, còn vai trò của 2 loài ốc (R. swinhoei = R. auricularia swinhoeivà R. rubiginosa) chưa được xác định, trong gây nhiễm thực nghiệm cũng chưa thu được ấu trùng ở ốc R. rubiginosa(Kaset et al. 2010).
Như vậy, thành phần loài ốc họ Lymnaeidae và vai trò truyền bệnh sán lá gan
F. gigantica ở Việt Nam và Thái Lan tương tự nhau. Chỉ có ốc A. viridisđóng vai trò quan trọng trong truyền bệnh sán lá gan.Việc xác định chính xác vật chủ trung gian của sán lá gan rất quan trọng đối với việc xác định con đường lây nhiễm bệnh ở người và động vật, bởi vì các loài ốc có môi trường sống khác nhau: ốc A. viridis chủ yếu sống ở ruộng sấp nước; còn ốc R. auricularia
và R. rubiginosa chủ yếu sống ở nơi nước lớn như ao hồ, mương, sông (Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012, Dung et al. 2013). Từ đó có thể nhận định rằng rau cỏ ở những nơi ruộng sấp nước dễ bị nhiễm metacercaria của sán lá gan, còn ở những nơi nước lớn như ao, sông, hồ ít bị nhiễm metacercaria sán lá gan.Điều này góp phần lý giải tại sao số ca bệnh ở người bị nhiễm sán lá gan lớn tập trung ở miền Trung và miền Nam(Triệu Nguyên Trung và cs. 2012; Trần Vinh Hiển và cs. 2006), vì ở những vùng này người dân có tập quán trồng rau ngổ và dấp cá ở ruộng sấp nước, ngược lại ở miền Bắc thì rau ngổ được trồng ở ao và rau dấp cá trồng ở cạn. Có thể xác định rau dấp cá, rau ngổ ở miền trung là nguồn lây bệnh chính sán lá gan cho người.
Kết quả xác định vật chủ trung gian sán lá gan là A. viridis, loài ốc này sống ở ruộng sấp nước phù hợp với đặc tính sinh học của miracidium sán lá gan F. gigantica hoạt động và tìm vật chủ trung gian ở đáy nước, mà không bơi lên ở
43
mặt nước, sẽ có nhiều cơ hội tiếp xúc với miracidium sán lá gan ở những nơi sấp nước. Còn ốc R. auricularia và R. rubiginosa thường sống ở bề mặt những nơi nước lớn, vì vậy ít có cơ hội tiếp xúc với miracidium sán lá gan hơn.
3.2.2.4.2. Sự phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ốc A. viridis
Gây nhiễm ấu trùng sán lá gan F. gigantica cho ốc A. viridis ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau của mùa đông và mùa hè. Định kỳ mổ ốc sau 7, 15, 21,28 ngày để theo dõi sự phát triển của ấu trùng sán. Đến khi thấy có cercaria trưởng thành thì theo dõi hàng ngày để biết thời gian thoát nang của cercaria. Kết quả đã thu được các giai đoạn phát triển sporocyst, redia, cercaria. Sporocyst non có kích thước 100 x 75 µm. Redia non mới thoát khỏi sporocyst có hình dài, kích thước 500-568 x 95-100 µm (trung bình 535,2 x 96,5), hầu và ruột dài bằng 2/3 chiều dài cơ thể. Redia lớn dần về kích thước và tiếp tục sản sinh thế hệ redia tiếp theo hoặc hình thành cercaria. Redia trưởng thành chứa cercaria có kích thước 1.500-1.800 x 200-225 µm (trung bình 1678,3 x 214,8).
Mỗi redia có 5-6 cercaria.Cercaria gồm 2 phần thân và đuôi.Cercaria còn non thân có kích thước 475-575 x 300-362 µm (trung bình 510 x 320), đuôi dài 650-800 µm (trung bình 714). Cercaria trưởng thành có thân ngắn và đuôi dài gấp 4 lần thân: kích thước thân 250-325 x 225-250 µm (trung bình 250 x 239), đuôi dài 1.125-1.150 µm (trung bình 1.136). Phần thân cercaria chứa đầy tế bào tạo nang, môi bên từ giác bụng đến giác miệng có 60-70 hạt glygogen, đây là tế bào dự trữ năng lượng.
Cercaria thoát khỏi ốc hoạt động rất mạnh, tìm kiếm giá thể để bám vào rồi nhanh chóng rụng đuôi và phần thân hình thành metacercaria.Thời gian hóa nang khoảng 2 phút đến 1 giờ.Các tế bào tạo nang được tiết ra hình thành lớp