- Trứng sán lá gan thu từ mật bò được nuôi trong các điều kiện khác nhau: nước cất, nước muối 0,85% NaCl, 0,8% và PBS (Phosphate-buffered Saline chứa 0,8% NaCl), theo dõi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ mùa hè, mùa đông và nhiệt độ tủ ấm 370
C.
- Hàng ngày thay nước, kiểm tra dưới kính lúp để xác định sự phát triển của trứng, thời gian nở và tỷ lệ nở.
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium của sán lá gan lớn: lá gan lớn:
- Quan sát thời điểm nở trong ngày của miracidium: trước 6h, từ 6-7h, 7-8h, 8-9h, 9-10h, sau 10h và buổi chiều.
- Quan sát độ sâu ưa thích của miracidium: đáy nước hay bề mặt. Cho 100 miracidium vào cốc nước có chiều cao 5cm, sau đó hút dần từ trên xuống mỗi khoảng cách là 1cm để tính số lượng miracidium, từ đó xác định độ sâu ưa thích của miracidium.
- Quan sát thời gian sống của miracidium: hút 100 miracidium mới nở vào đĩa petri nhỏ. Quan sát sau mỗi 1giờ để tính số lượng miracidium chết và thời gian sống tối đa của miracidium.
2.4.7. Phương pháp gây nhiễm miracidium sán lá gan lớn cho ốc
- Hai loài ốc phổ biến thuộc họ Lymnaeidae là Austropeplea viridis(= L. viridis) vàRadix auricularia (= L. swinhoei) ở Việt Nam bắt ngoài tự nhiên, nuôi trong phòng thí nghiệm cho đẻ ra thế hệ ốc sạch.
- Gây nhiễm cho ốc bằng cách đếm số lượng ốc cho vào các đĩa petri, nhỏ miracidium mới nở vào với số lượng 5 miracidium/ốc.
- Nuôi ốc bằng rau diếp, thay nước hàng ngày. Định kỳ xét nghiệm ốc để xác định sự phát triển của ấu trùng trong ốc và thời gian cercaria thoát khỏi ốc.Những ốc chết cũng được xét nghiệm ngay để tính tỷ lệ nhiễm.
18
2.4.8. Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria sán lá gan lớn. sán lá gan lớn.
- Theo dõi thời gian hóa nang của cercaria. Hút cercaria mới thoát khỏi ốc vào đĩa petri, cho thêm lá cây vào, theo dõi thời gian hóa nang.
- Theo dõi sức sống của metacercaria trong các nồng độ muối khác nhau. Dùng lá chuối thả vào cốc chứa ốc nhiễm ấu trùng sán lá gan để metacercaria bám vào, đếm 100 metacercaria trên lá nhúng vào dung dịch muối NaCl nồng độ 0,9%, 1,0% và 1,5%.Sau 15 phút lấy ra 50 metacercaria để kiểm tra sự sống dưới kính hiển vi, 50 metacercaria còn lại theo dõi tiếp ở 30 phút. Metacercaria được xác định là chết khi không còn vận động và các tế bào bị co lại, thay đổi cấu trúc.
2.4.9. Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và chỉ số đo hình thái được tính theo ( min – max) mean STDEV
19
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam3.1.1. Đặc điểm hình thái sán lá ganFasciola spp. ở Việt Nam. 3.1.1. Đặc điểm hình thái sán lá ganFasciola spp. ở Việt Nam.
Sán lá gan có dạng hình lá, giác miệng và giác bụng nằm gần nhau ở phần trước cơ thể.Hầu lớn, ruột phân nhánh (hình 3.1).Tuyến noãn hoàng phát triển, gồm nhiều bao noãn phủ đầy cơ thể.Tinh hoàn và buồng trứng phân thùy nằm ở vùng giữa cơ thể, sau giác bụng.Đa số sán lá gan tại các địa điểm nghiên cứu có cơ thể thon dài, một số cá thể có dạng ngắn hơn.Kích thước các quần thể sán ở 3 địa điểm nghiên cứu tương đương nhau (Bảng 3.1). Tỷ lệ chiều dài/rộng của sán dao động lớn (từ 2,2 - 6,0). So với số liệu của Periago et al. (2006) thì đa số sán giống F. gigantica (BL/BW >3,4), một số sán có đặc điểm của loài F. hepatica (BL/BW<2,8), và một số có dạng trung gian giữa 2 loài (BL/BW = 2,9 - 3,3) (Hình 3.2).
20
Hình 3.2. Các dạng hình thái của sán lá gan lớn thu từ bò
a. Dạng ngắn (BL/BW=2,3); b. Dạng trung gian (BL/BW=2,9) c, d, e. Dạng dài (BL/BW=3,4; 3,8; 6,0)
Bảng 3.1. Kích thƣớc sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Chiều dài cơ
thể (cm) Chiều rộng cơ thể (cm) Tỷ lệ dài/rộng Mút sau giác bụng đến cuối cơ thể (cm) Hà Nội 1,9 - 5,0 (3,27 ± 0,69) 0,5 - 1,8 (0,95 ± 0,19) 2,7 - 4,8 (3,48 ± 0,47) 1,7 - 4,4 (2,89 ± 0,61) Nghệ An 2,0 - 4,9 (3,02 ± 0,62) 0,5 - 1,4 (0,93 ± 0,17) 2,2 - 4,6 (3,30 ± 0,57) 1,7 - 4,4 (2,68 ± 0,57) Tây Ninh 1,9 - 4,6 (2,93 ± 0,71) 0,5 - 1,3 (0,89 ± 0,22) 2,3 - 6,0 (3,34 ± 0,59) 1,6 - 4,0 (2,57 ± 0,62) F. hepatica* 1,2 - 2,9 0,6 - 1,2 1,3 - 2,8 0,8 - 2,5 F. gigantica* 3,1 - 5,2 0,5 - 1,4 3,4 - 6,8 2,6 - 5,0 *
Theo Periago et al. (2006)
Trong tổng số 165 cá thể sán từ 3 địa điểm nghiên cứu, nhóm có hình dạng cơ thể dài giống F. gigantica chiếm ưu thế (49,1%), sau đó đến nhóm trung gian
21
(35,2%) và nhóm giống F. hepatica (15,8%). Kích thước chiều dài cơ thể sán của 3 nhóm có sự chồng lấn nhau: nhóm giống F. hepatica có chiều dài cơ thể là 1,6-3,3 cm, nhóm trung gian là 2,0-4,3 cm và nhóm giống F. gigantica là 2,1-5,0 cm. Kích thước trứng của 3 nhóm đều tương tự như nhau (p>0,05) và phù hợp với số đo của loài F. gigantica (trứng > 150 90 µm). Khoảng cách từ mút sau giác bụng đến cuối cơ thể của các nhóm cũng tương tự nhau, chiếm 87,3- 88,8% chiều dài cơ thể (Bảng 3.2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2. So sánh kích thƣớc của các nhóm sán lá gan có hình dạng cơ thể khác nhau Kích thước Nhóm sán lá gan có hình thái DạngF. hepatica N=26 (15,8%) Dạng Trung gian N = 58 (35,2%) Dạng F. gigantica N = 81 (49,1%) Chiều dài cơ thể
(cm) 1,6 - 3,3 (2,43 ± 0,39) 2,0 - 4,3 (3,02 ± 0,66) 2,05 - 5,0 (3,32 ± 0,64) Chiều rộng cơ thể (cm) 0,6 - 1,0 (0,95 ± 0,16) 0,6 - 1,3 (0,97 ± 0,20) 0,5 - 1,3 (0,88 ± 0,19) Tỷ lệ dài/rộng 2,2 - 2,8 (2,13 ± 0,36) 2,9 – 3,3 (3,12 ± 0,13) 3,4 – 6,0 (3,81 ± 0,40) Mút sau giác bụng đến cuối cơ thể (cm) 1,4 – 2,9 (2,13 ± 0,36) 2,9 – 3,3 (3,12 ± 0,13) 1,8 – 4,4 (2,95 ± 0,56) Tỷ lệ % của mút sau giác bụng đến mút cuối cơ thể/ dài cơ thể 81,3 – 91,3 (87,3 ± 0,23) 83,3 – 90,9 (87,9 ± 0,17) 82,7 – 96,1 (88,8 ± 0,19) Trứng (µm) 150 – 176 x 90 – 100 (156 ± 16 x 920 ± 9) 150 – 180 x 90 – 100 (153 ± 15 x 930 ± 9) 150 – 176 x 90 – 110 (154 ± 15 x 930 ± 9)
3.1.2. Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 dựa trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2
Kết quả giải trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 9 mẫu sán lá gan đại diện cho các nhóm hình thái từ các địa điểm nghiên cứu đã thu được 9 trình tự (Bảng 3.3).
22
Kết quả so sánh cho thấy tất cả các trình tự của sán có cơ thể dài và dạng trung gian hoàn toàn tương đồng với nhau, 2 trình tự của sán có cơ thể ngắn tương đồng với nhau và trình tự của 1 mẫu (TN3- Ngắn) có một số vị trí mang 2 đỉnh (hình 3.3). Đối chiếu với các trình tự trên Genbank bằng chương trình BLAST đã xác định các trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của sán có cơ thể dài và dạng trung gian 100% tương đồng với loài F. gigantica, còn sán có cơ thể ngắn hơn có trình tự tương đồng với loài F. hepatica (Bảng 3.3). Trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài khác nhau ở 12 vị trí nucleotide (Bảng 3.4).Cây phát sinh chủng loại được xây dựng từ bộ dữ liệu trình tự ITS1-5.8S-ITS2 bằng phương pháp Neighbor-Joining cho thấy các trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài F. gigantica và F. hepatica tách thành 2 nhánh rõ ràng. Trình tự của sán dạng dài và trung gian của Việt Nam thuộc loài F. gigantica và trình tự của sán dạng ngắn thuộc loài F. hepatica (hình 3.4).
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu
STT Mã số mẫu nghiên cứu Đặc điểm cơ thể Kích thước trứng ITS1-5.8S- ITS2
1 HN 1- Dài F. gigantica F. gigantica F. gigantica
2 HN 2 – Trung gian Trung gian F. gigantica F. gigantica
3 HN 3 – Ngắn F. hepatica F. gigantica F. hepatica
4 NA 1- Dài F. gigantica F. gigantica F. gigantica
5 NA 2 – Trung gian Trung gian F. gigantica F. gigantica
6 NA 3 – Ngắn F. hepatica F. gigantica F. hepatica
7 TN 1- Dài F. gigantica F. gigantica F. gigantica
8 TN 2 – Trung gian Trung gian F. gigantica F. gigantica
9 TN 3 – Ngắn F. hepatica F. gigantica F. hepatica/F.
23
Bảng 3.4. So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài sán lá gan
F. hepatica và F. gigantica
F. hepatica ACTCTCACAC AAGCGATACA CGTGTGACCG TCATGTCATG CGATAAAAAT TTGCGGACGG [ 60]
F. gigantica ...T.... ... ... ... ... ...[ 60]
F. hepatica CTATGCCTGG CTCATTGAGG TCACAGCATA TCCGAACACT GATGGGGTGC CTACCTGTAT [120]
F. gigantica ... ... ... ...T.... ... ... [120]
F. hepatica GATACTCCGA TGGTATGCTT GCGTCTCTCG GGGCGCTTGT CCAAGCCAGG AGAACGGGTT [180]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [180]
F. hepatica GTACTGCCAC GATTGGTAGT GCTAGGCTTA AAGAGGAGAT TTGGGCTACG GCCCTGCTCC [240]
F. gigantica ...T ... ... ... ... ... [240]
F. hepatica CGCCCTATGA ACTGTTTCAT TACTACATTT ACACTGTTAA AGTGGTACTG AATGGCTTGC [300]
F. gigantica ... ... ...A.. ... ...T.. ... [300] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
F. hepatica CATTCTTTGC CATTGCCCTC GCATGCACCC GGTCCTTGTG GCTGGACTGC ACGTACGTCG [360]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [360]
F. hepatica CCCGGCGGTG CCTATCCCGG GTTGGACTGA TAACCTGGTC TTTGACCATA CGTACAACTC [420]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [420]
F. hepatica TGAACGGTGG ATCACTCGGC TCGTGTGTCG ATGAAGAGCG CAGCCAACTG TGTGAATTAA [480]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [480]
F. hepatica TGCAAACTGC ATACTGCTTT GAACATCGAC ATCTTGAACG CATATTGCGG CCATGGGTTA [540]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [540]
F. hepatica GCCTGTGGCC ACGCCTGTCC GAGGGTCGGC TTATAAACTA TCACGACGCC CAAAAAGTCG [600]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [600]
F. hepatica TGGCTTGGGT TTTGCCAGCT GGCGTGATCT CCTCTATGAG TAATCATGTG AGGTGCCAGA [660]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [660]
F. hepatica TCTATGGCGT TTCCCTAATG TATCCGGATG CACCCTTGTC TTGGCAGAAA GCCGTGGTGA [720]
F. gigantica ... ... ... ... ... ... [720]
F. hepatica GGTGCAGTGG CGGAATCGTG GTTTAATAAT CGGGTTGGTA CTCAGTTGTC AGTGTGTTTG [780]
F. gigantica ... ... ... ... ... ...C. [780]
F. hepatica GCGATCCCCT AGTCGGCACA CTTATGATTT CTGGGATAAT TCCATACCAG GCACGTTCCG [840]
24
F. hepatica TCACTGTCAC TTTGTCATTG GTTTGATGCT GAACTTGGTC ATGTGTCTGA TGCTATTTTC [900]
F. gigantica .T...T.. ... ... ... ... ...-. [900]
F. hepatica ATATAGCGAC GGTACCCTTC GTGGTCTGTC TTCCTGACCT CGGTTCAGAC GTGATTAC [958]
F. gigantica ...A.... ... ... ... ... ... [958]
25
Hình 3.4. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài Fasciola spp.đƣợc xây
26
3.1.3. Thảo luận
Theo phương pháp định loại truyền thống, hai loài sán lá gan lớn F. gigantica
và F. hepatica được phân biệt bởi kích thước và hình dạng cơ thể, cũng như kích thước trứng (Kendall 1965; Dalton 1999).Tuy nhiên, kích thước cơ thể thay đổi phụ thuộc vào giai đoạn phát triển. Hơn nữa, không phải tất cả các cá thể sán đều mang đặc điểm điển hình của một trong 2 loài, nhiều dạng lai và trung gian giữa 2 loài đã được công bố (Dalton 1999; Mas-Coma et al. 2009), vì vậy đôi khi gặp khó khăn trong việc phân biệt 2 loài sán lá gan. Với mục đích tìm ra đặc điểm phân biệt 2 loài chính xác nhất, Periago et al. (2006) đã nghiên cứu tỷ mỉ về hình thái, với 30 số đo của số lượng lớn mẫu sán lá gan tại những vùng chỉ có một loài F. gigantica hoặc F. hepatica bằng cùng một phương pháp định hình mẫu. Tác giả cho thấy khi chỉ xem xét đặc điểm hình thái, mà không chú ý đến sự phát triển tương quan, tất cả các số đo kích thước sán trưởng thành đều có sự chồng lấn giữa 2 loài. Tuy nhiên, phân tích tương quan cho thấy đặc điểm đặc trưng của F. gigantica là phát triển theo chiều dài, còn F. hepatica phát triển theo chiều ngang. Tỷ lệ chiều dài/chiều rộng cơ thể (BL/BW) là giá trị chính xác để phân biệt 2 loài, ngoài ra khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút cuối cơ thể cũng không có sự chồng chéo. Về trứng của 2 loài sán lá gan, ngưỡng để phân biệt trứng của 2 loài là 150 x 90 µm: trứng loài F. hepatica nhỏ hơn ngưỡng này, còn trứng F. gigantica lớn hơn (Dalton 1999; Mas-Coma et al. 2009).
Định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam có nhiều công bố không thống nhất, thậm chí trái ngược nhau. Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương (1987) mô tả 2 loài sán lá gan F. gigantica và F. hepatica ở một số tỉnh miền Nam: loài F. gigantica có kích thước 3.5-5.5 x 0.5-1.2 cm và trứng 150-197 x 90-100 µm; loài F. hepatica có kích thước 2.0-3.0 x 0.8cm và trứng 130-140 x 70-90 µm. Rõ ràng đây là số đo của 2 loài riêng biệt. Lê Hữu Khương và cs. (2001) cũng công bố 2 loài sán lá gan ở các vùng trong cả nước, tuy nhiên tác giả không
27 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cung cấp hình ảnh và kích thước của sán. Những năm sau đó, nhiều tác giả sử dụng kỹ thuật phân tử trong định loại sán lá gan.Lê Thanh Hòa và Nguyễn Văn Đề (2002) phân tích gen ty thể nad1 đã kết luận sán lá gan ở Việt Nam là loài F. gigantica. Đặng Tất Thế và cs. (2003) nghiên cứu sán lá gan lớn ở trâu bò và người ở Bình Định và Khánh Hòa đã thu được dạng giống F. hepatica, dạng trung gian và dạng giống F. gigantica, nhưng không phân tích số đo. Tuy nhiên, khi phân tích trình tự gen CO1 thì thấy tất cả đều thuộc loài F. gigantica.Le et al. (2008) cũng công bố kết quả tương tự, đồng thời cho thấy một số mẫu mang đoạn chèn ITS2 trong hệ gen nhân của loài F. hepatica
hoặc F. gigantica, hoặc trình tự của cả 2 loài. Chứng tỏ có sự lai hoặc chuyển gen giữa 2 loài. Nhưng tác giả không biết chắc ở Việt Nam có tồn tại loài F. hepatica thuần hay không.Nguyen et al. (2009) nghiên cứu sán lá gan ở dê và cừu ở Việt Nam thấy đa số sán có hình dạng giống F. gigantica và một số cá thể có hình thái giống F. hepatica, tuy nhiên nghiên cứu này cũng không có số đo kích thước sán. Nghiên cứu phân tử cho thấy mẫu sán lá gan ngắn thu từ dê có trình tự ITS2 giống với loài F. hepatica. Nhưng tất cả các mẫu sán lá gan từ dê có trình tự CO1 tương đồng cao với F. gigantica (97–100%). Có thể các cá thể này đã mang gen lai giữa 2 loài và dòng mẹ của chúng là F. gigantica. Đỗ Ngọc Ánh và cs. (2011b) xác định loài sán lá gan lớn ở miền Trung và Tây Nguyên là loài F. gigantica bằng gen CO1. Ở một nghiên cứu khác tại các tỉnh miền Bắc, Đỗ Ngọc Ánh và Đỗ Khắc Lực (2012) lại công bố 81,4% số mẫu có hình thái giống với F. hepatica và 18,6% có hình thái trung gian, không có cá thể nào có hình thái của loài F. gigantica. Nhưng trình tự gen CO1 của chúng đều thuộc loài F. gigantica. Điều đó chứng tỏ kết quả định loài hình thái và phân tử không thống nhất nhau và hoàn toàn trái ngược với kết quả nghiên cứu trước đây chủ yếu thu được sán lá gan có hình dạng của loài F. gigantica, rất ít sán có hình dạng giống F. hepatica. Có thể do tác giả ép sán lúc còn sống trước khi định hình trong cồn, đã làm thay đổi hình
28
dạng và kích thước của sán, làm cho chúng to hơn theo chiều ngang giống với loài F. hepatica. Cùng năm đó, Nguyen et al. 2012 phân tích trình tự ITS1 và ITS2 của 16 mẫu sán lá gan ở Khánh Hòa cho thấy 13 mẫu là F. gigantica, chỉ có 3 mẫu có trình tự của con lai giữa F. gigantica và F. hepatica. Tuy nhiên, tất cả đều có trình tự gen ty thể (CO1) của loàiF. gigantica.Như vậy có thể nói, các công bố trước đây về định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam không thống nhất với nhau, các nghiên cứu này đã không mô tả phương pháp định hình mẫu và đa số không cung cấp số đo kích thước của sán.
Trong nghiên cứu này ở 3 tỉnh đại diện cho 3 miền của Việt Nam, với cùng một phương pháp xử lý mẫu theo phương pháp chuẩn của Periago et al. (2006), chúng tôi thấy rằng đa số sán có cơ thể dài thuộc dạngF. gigantica, một số ít có cơ thể ngắn hoặc dạng trung gian. Tuy nhiên, trứng của chúng đều thuộc loài F. gigantica.Kết quả phân tích trình tự ITS1-5.8S-ITS2 cho thấy sán dạng dài và trung gian thuộc loài F. gigantica, còn dạng ngắn thuộc loài F. hepatica hoặc mang trình tự của cả 2 loài. Mẫu sán mang trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của cả 2 loài chắc chắn là dạng lai hoặc chuyển gen giữa 2 loài sán lá gan. Với những cá thể mang trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của F. hepatica có thể là dòng thuần hoặc dạng lai.Để khẳng định điều này thì phân tích thêm trình tự gen ty thể sẽ cho kết quả chính xác.Trong nghiên cứu này, chúng tôi không phân tích gen ty thể.Tuy nhiên, có thể khẳng định sán dạng ngắn là các cá thể lai hoặc chuyển gen giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica,