3.3.2.1 Pha loãng huyết thanh
Cho vào ống nghiệm vô trùng 4,5ml dung dịch đệm và 0,5ml huyết thanh, ta được dung dịch huyết thanh có nồng độ 1/10.
0,5ml huyết thanh
4,5ml dung dịch đệm
Huyết thanh Huyết thanh có nồng độ 1/10
22
3.3.2.2 Tiến hành phản ứng
Trên mỗi giếng của đĩa nhựa ta dùng micro pipet hút 50µl huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ 1/10, nhỏ lần lượt vào 24 giếng. Sau đó ta dùng micro pipet hút 50µl kháng nguyên cho vào 24 giếng có chứa 50µl huyết thanh đã pha loãng như trên, mỗi giếng tương ứng 1 chủng. Như vậy, tính chung huyết thanh đã được pha loãng ở nồng độ 1/20.
Sau khi cho huyết thanh và kháng nguyên vào mỗi giếng ta lắc nhẹ, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ hoặc để ở nhiệt độ thường 2 giờ.
Nhỏ 1 giọt lên lame, đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen có độ phóng đại 100 lần.
3.3.2.3 Tiến hành đối chứng âm
Nhỏ 50µl nước sinh lý và 50µl kháng nguyên vào mỗi giếng trên đĩa nhựa, 1 giếng tương với 1 chủng Leptospira. Dưới kính hiển vi tụ quang nền đen, Leptospira xuất hiện với chuyển động tốt và không tự ngưng kết.
3.3.2.4 Đánh giá kết quả
Dưới kính hiển vi nền đen với độ phóng đại 100 lần, độ ngưng kết được đánh giá:
Âm tính (-): xoắn khuẩn không ngưng kết, di động tự do như đối chứng âm.
Dương tính (+): trên vi trường xuất hiện những cụm hay mảng ngưng kết trắng đục, rìa có tua do xoắn khuẩn Leptospira dính vào nhau, số Leptospira
tự do ít so với đối chứng âm. Dựa vào mức độ ngưng kết để đánh giá kết quả dương tính theo TCVN 8400 - 15:2011 như sau:
+ + + +: Tất cả Leptospira ngưng kết, cụm ngưng kết lớn, không có xoắn khuẩn tự do.
+ + +: Trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, ít xoắn khuẩn tự do. + +: Từ 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, có 1/2 số xoắn khuẩn tự do. +: Từ 25% đến dưới 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do.
23
Âm tính Nghi ngờ
Ngưng kết 1+ Ngưng kết 2+
Ngưng kết 3+ Ngưng kết 4+
24