3.2.1 Địa điểm và thời gian
Địa điểm:
Các điểm mua bán chuột xung quanh địa bàn thành phố Cần Thơ.
Các điểm đặt chuột như ký túc xá trường Đại học Cần Thơ, tại nhà của các hộ dân trên địa bàn thành phố Cần Thơ.
Thực hiện phản ứng MAT tại phòng thí nghiệm vi trùng học, bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và SHƯD trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian tiến hành từ tháng 08/2014 đến tháng 11/2014.
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị bao gồm autoclave, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, kính hiển vi tụ quang nền đen, máy ly tâm.
Dụng cụ gồm ống nghiệm, ống tiêm, giá đựng ống nghiệm, đĩa nhựa đáy tròn, lame, pipet từ 0,5ml đến 10ml, micro pipet, cồn 96o, găng tay, khẩu trang, kính bảo hộ.
Hóa chất gồm NaCl, nước cất hai lần, Na2HPO4 khan, NaH2PO4.H2O dùng để pha dung dịch muối đệm phosphate (PBS) đậm đặc. Dung dịch muối đệm phosphate (PBS) đậm đặc được pha theo công thức như sau:
˗Na2HPO4 khan: 12,36g ˗NaH2PO4.H2O: 1,80g
˗NaCl: 85,00g
˗Nước cất 2 lần: 1000ml
Dung dịch đệm dùng trong phản ứng vi ngưng kết trên phiến kính PBS có nồng độ 0,01M và có pH=7,2 - 7,4.
˗Dung dịch PBS đậm đặc: 100ml
19
3.2.3 Nguyên liệu dùng trong thí nghiệm
Huyết thanh của chuột.
Kháng nguyên dùng trong phản ứng MAT là bộ kháng nguyên chuẩn gồm 24 serovar phổ biến đang được sử dụng để chẩn đoán bệnh do Leptospira
20
Bảng 1: Danh mục 24 serovar dùng trong phản ứng vi ngưng kết
TT Nhóm kháng nguyên
1 AUSTRALIS L. australis Ballico
2 AUTUMNALIS L. autumnalis Akiyami A
3 BATAVIAE L. bataviae Van Tienen
4 CANICOLA L. canicola Hond Utrecht IV
5 BALLUM L. castellonis Castellon 3
6 ICTEROHAEMORRHAGIAE L. copenhageni Wijnberg
7 PYROGENES L. pyrogenes Salinem
8 ICTEROHAEMORRHAGIAE L. tonkini LT 96 68
9 ICTEROHAEMORRHAGIAE L. icterohaemorrhagiae Verdun (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10 CYNOPTERIE L. cynopterie 3522 C
11 GRYPPOTYPHOSA L. gryppotyphosa Moskva V
12 SEJROE L. hardjo Hardjo Bovis
13 HEBDOMADIS L. hebdomadis Hebdomadis
14 JAVANICA L. javanica Veldrat Bataviae 46
15 PANAMA L. panama CZ 214K
16 SEMARANGA L. patoc Patoc I
17 POMONA L. Pomona Pomona
18 TARASSOVI L. tarassovi Mitis Johnson
19 TARASSOVI L. vughia LT 09 68
20 SEJROE L. hardjo Hardjoprajitno
21 SEJROE L. saxkoebing Mus 24
22 CANICOLA L. canicola Chiffon
23 LOUISIANA L. Louisiana LSU 1945
21
Bộ kháng nguyên chuẩn được nuôi cấy trên môi trường EMJH và giữ ở nhiệt độ 28oC - 30oC. Trước khi tiến hành làm thí nghiệm phải tiến hành kiểm tra bộ kháng nguyên ở các chỉ tiêu như sự chuyển động, sự tự ngưng kết của kháng nguyên, sự thuần khiết và mật độ từ 100 - 200 con trên một vi trường (độ phóng đại 400 lần).
3.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện bằng phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT) với kháng nguyên sống trên phiến kính.
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu
Chuột được lấy ngẫu nhiên: chuột đồng thu thập tại các chợ; chuột cống được bắt bằng bẫy tại các bãi rác, cống rãnh, đường mương trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Tiến hành lấy máu tim hoặc máu tĩnh mạch đuôi. Nhưng vì chuột thường nhỏ nên khó lấy máu qua tĩnh mạch, vì vậy sau khi mua và thu gom từ các bẫy về phải tiến hành mổ chuột lấy máu trực tiếp từ tim, cách làm này phải nhanh và đảm bảo vô trùng, thu được nhiều máu, mỗi chuột lấy 2 - 3ml, để nghiêng chờ máu đông rồi đem ly tâm chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh thì cho vào tủ lạnh để bảo quản.
3.3.2 Thực hiện phản ứng định tính
3.3.2.1 Pha loãng huyết thanh
Cho vào ống nghiệm vô trùng 4,5ml dung dịch đệm và 0,5ml huyết thanh, ta được dung dịch huyết thanh có nồng độ 1/10.
0,5ml huyết thanh
4,5ml dung dịch đệm
Huyết thanh Huyết thanh có nồng độ 1/10
22
3.3.2.2 Tiến hành phản ứng
Trên mỗi giếng của đĩa nhựa ta dùng micro pipet hút 50µl huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ 1/10, nhỏ lần lượt vào 24 giếng. Sau đó ta dùng micro pipet hút 50µl kháng nguyên cho vào 24 giếng có chứa 50µl huyết thanh đã pha loãng như trên, mỗi giếng tương ứng 1 chủng. Như vậy, tính chung huyết thanh đã được pha loãng ở nồng độ 1/20. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi cho huyết thanh và kháng nguyên vào mỗi giếng ta lắc nhẹ, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ hoặc để ở nhiệt độ thường 2 giờ.
Nhỏ 1 giọt lên lame, đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen có độ phóng đại 100 lần.
3.3.2.3 Tiến hành đối chứng âm
Nhỏ 50µl nước sinh lý và 50µl kháng nguyên vào mỗi giếng trên đĩa nhựa, 1 giếng tương với 1 chủng Leptospira. Dưới kính hiển vi tụ quang nền đen, Leptospira xuất hiện với chuyển động tốt và không tự ngưng kết.
3.3.2.4 Đánh giá kết quả
Dưới kính hiển vi nền đen với độ phóng đại 100 lần, độ ngưng kết được đánh giá:
Âm tính (-): xoắn khuẩn không ngưng kết, di động tự do như đối chứng âm.
Dương tính (+): trên vi trường xuất hiện những cụm hay mảng ngưng kết trắng đục, rìa có tua do xoắn khuẩn Leptospira dính vào nhau, số Leptospira
tự do ít so với đối chứng âm. Dựa vào mức độ ngưng kết để đánh giá kết quả dương tính theo TCVN 8400 - 15:2011 như sau:
+ + + +: Tất cả Leptospira ngưng kết, cụm ngưng kết lớn, không có xoắn khuẩn tự do.
+ + +: Trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, ít xoắn khuẩn tự do. + +: Từ 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, có 1/2 số xoắn khuẩn tự do. +: Từ 25% đến dưới 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do.
23
Âm tính Nghi ngờ
Ngưng kết 1+ Ngưng kết 2+
Ngưng kết 3+ Ngưng kết 4+
24
3.3.3 Phản ứng định lượng Nâng hiệu giá pha loãng Nâng hiệu giá pha loãng
Qua phản ứng định tính, nếu mẫu huyết thanh xét nghiệm ở mức độ ngưng kết 2+, 3+, 4+ thì tiếp tục nâng hiệu giá pha loãng huyết thanh lên 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320,… bằng cách lấy 1ml huyết thanh ở nồng độ 1/10 pha với 1ml dung dịch đệm ta được huyết thanh có nồng độ pha loãng 1/20. Cứ như vậy pha loãng huyết thanh đến mức cần thiết. Thực hiện phản ứng với các chủng dương tính đến khi nào âm tính hoặc dương tính nhưng mức độ ngưng kết dưới 2+ thì mẫu huyết thanh được xem là xét nghiệm hoàn tất.
1ml 1ml dung dịch đệm
1ml 1ml 1ml
1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
25
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành lấy và kiểm tra 95 mẫu huyết thanh chuột, trong đó có 51 mẫu huyết thanh chuột đồng và 44 mẫu huyết thanh chuột cống. Kết quả được trình bày qua các bảng sau:
4.1 Kết quả tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột
Trong tổng số 95 mẫu huyết thanh đã kiểm tra có 27 mẫu dương tính với
Leptospira với tỷ lệ 28,42%.
Theo một số tác giả trước đây như Quách Quốc Nam, tại thành phố Cần Thơ tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột là 32,52%.
Theo Hoàng Mạnh Lâm và ctv (2002), tỷ lệ dương tính với Leptospira
trên chuột ở ĐakLak là 21,1%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Năm 2013, Halliday et al., ở Kibera - một khu ổ chuột gần Nairobi, Kenya thuộc Châu Phi có tỷ lệ dương tính với xoắn khuẩn trên chuột là 18,3%.
Theo Romero - Vivas et al., (2013), chuột trong một khu phố thuộc thành phố cảng biển của Colombia có 20,4% (10/49) mẫu huyết thanh dương tính với Leptospira.
Tuy nhiên, kết quả cũng thấp hơn so với Vũ Đình Hưng và ctv (2002), tại Hà Nội chuột nhiễm Leptospira với tỷ lệ là 43,8%; Lý Thị Liên Khai (2012), tỷ lệ dương tính chung ở chuột tại Công ty cổ phần thủy sản sông Hậu là 55,55%.
28,42%
71,58%
Biểu đồ 1: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột
Dương tính Âm tính
26
Điều này được giải thích là do Leptospirosis là một bệnh có tính chất nguồn dịch thiên nhiên (Srivastava and Harbola, 1990). Bệnh thường bùng phát vào mùa mưa lũ tập trung từ tháng 7 đến tháng 10 vì mùa này chuột sinh sản nhiều. Mặc khác, ở những nơi hoàn cảnh địa lý phức tạp có nhiều cống, rãnh; kênh, mương; cơ sở, trại chăn nuôi như Hà Nội và Công ty cổ phần thủy sản sông Hậu thì càng thuận lợi cho sự phân bố và tồn tại của Leptospira, mà chuột là loài gặm nhấm mang và bài thải trực tiếp mầm bệnh ra ngoài môi trường qua nước tiểu.
Tuy kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng và ctv (2002); Lý Thị Liên Khai (2012) cao hơn của chúng tôi nhưng vẫn rất đáng quan tâm, vì qua kết quả trên cho thấy vai trò quan trọng và mức độ nguy hiểm của chuột trong sự lây nhiễm tự nhiên của Leptospirosis.
4.2 Kết quả tỷ lệ dương tính với Leptospira theo loại chuột Bảng 2: Tỷ lệ dương tính với Leptospira theo loại chuột Bảng 2: Tỷ lệ dương tính với Leptospira theo loại chuột
Loại chuột Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) (*) P Chuột cống 44 17 38,64a 0,04 Chuột đồng 51 10 19,61b Tổng 95 27
Ghi chú: (*) Các chữ khác nhau thì sai khác nhau về mặt thống kê.
38,64% 19,61% 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 Chuột cống Chuột đồng Loại chuột
Biểu đồ 2: Tỷ lệ dương tính với Leptospira theo loại chuột
27
Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên các loại chuột là không giống nhau. Chuột cống có tỷ lệ nhiễm là 38,64% cao hơn chuột đồng là 19,61%. Chuột cống có tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính Leptospira cao hơn chuột đồng, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05).
Kết quả này cũng phù hợp với Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2010), tỷ lệ dương tính với Leptospira trên chuột cống là 40,9%. Vũ Đình Hưng và ctv (2002), tại Hà Nội tỷ lệ nhiễm Leptospira ở chuột cống 50,31%, chuột nhà 24,03%. Ở Cần Thơ, Quách Quốc Nam (2007), tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột đồng là 23,28%, An Giang, Khưu Bách Thông (2002), tỷ lệ nhiễm
Leptospira trên chuột đồng là 57%.
Chuột cống có tỷ lệ dương tính với Leptospira cao hơn chuột đồng là do chuột cống ăn tạp, chúng sống gần các trang trại, khu công nghiệp, khu dân cư, ở các chợ, bãi rác, cống rãnh,... đây là những nơi có nhiều mầm bệnh khu trú. Bên cạnh đó, chuột cống lại có tuổi thọ cao hơn chuột đồng nên cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh cũng nhiều hơn.
Theo chúng tôi sự khác biệt giữa tỷ lệ nhiễm trên chuột cống ở xung quanh nội ô Thành phố Cần Thơ (38,64%) với tỷ lệ nhiễm trên chuột cống ở Hà Nội (50,31%) là do điều kiện khí hậu ở từng nơi khác nhau. Hoặc do trước đây do ngành chăn nuôi của nước ta chưa phát triển mạnh; kinh tế còn nhiều khó khăn; việc vệ sinh sát trùng chuồng trại và phòng ngừa dịch bệnh trên đàn gia súc chưa được quan tâm đúng mức; nước thải chưa qua xử lý; xác súc vật chết bị vứt bừa bãi xuống sông ngòi, kênh, mương,... vì vậy mầm bệnh được tồn trữ và phát tán nhanh chóng.
Sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm trên chuột còn được thể hiện trên chuột đồng, kết quả của chúng tôi cho thấy tỷ lệ dương tính ở chuột đồng tại thành phố Cần Thơ là 19,61%, trong khi theo nghiên cứu của Khưu Bách Thông (2002) chuột đồng ở An Giang nhiễm Leptospira với tỷ lệ là 57%. Nguyên nhân của sự khác biệt trên là do An Giang có nhiều nơi bị ngập lụt; nhiều sông ngòi, kênh mương; mưa lũ quanh năm rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Leptospira.
28
4.3 Kết quả tỷ lệ nhiễm ghép giữa các chủng Leptospira trên chuột Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm ghép giữa các chủng Leptospira trên chuột Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm ghép giữa các chủng Leptospira trên chuột
Số chủng Leptospira nhiễm ghép Tỷ lệ dương tính Chuột cống (n=17) Tỷ lệ (%) Chuột đồng (n=10) Tỷ lệ (%) 2 3 17,65 4 40,00 3 5 29,41 - - 4 1 5,88 - - 6 1 5.88 - - Tổng 10 4
Trong tổng số 17 mẫu huyết thanh chuột cống dương tính có 10 mẫu nhiễm ghép từ 2 đến 6 chủng Leptospira. Trong đó nhiễm ghép 3 chủng cao nhất là 29,41%, 2 chủng chiếm 17,65%, thấp nhất ở nhiễm 4 chủng và 6 chủng là 5,88%, không có mẫu nhiễm ghép ở 5 chủng.
Trên chuột đồng, trong số 10 mẫu huyết thanh dương tính có 4 mẫu nhiễm ghép 2 chủng với tỷ lệ 40%, không có mẫu nhiễm ghép ở 3, 4, 5 và 6 chủng.
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy, số mẫu huyết thanh nhiễm ghép 2, 3, 4, 6 chủng ở chuột cống cao hơn chuột đồng, ở chuột đồng có 4 mẫu nhiễm ghép 2 chủng.
Kết quả này khác so với kết quả của Khưu Bách Thông (2002) là chuột đồng tại An Giang nhiễm ghép 2 chủng là 17,8%, 3 chủng là 9,6 % và 4 chủng là 2,7%. Quách Quốc Nam (2007), chuột cống nhiễm ghép 2 chủng là 43,48%, 3 chủng là 8,69%, 4 và 5 chủng là 4,35%.
Từ đó cho thấy chuột cống là loài gặm nhấm mang Leptospira nhiều hơn chuột đồng nên khả năng phát tán mầm bệnh cũng cao hơn. Mặc khác, chuột cống là loài gặm nhấm thường sống ở cống rãnh, bãi rác, khu dân cư, khu vực chăn nuôi, các chợ,... nên chúng có cơ hội tiếp xúc với nhiều mầm bệnh khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
29
4.4 Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết
Bảng 4: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết
Mức hiệu giá Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
1/20 20 74,07
1/40 7 25,93
Tổng 27 100,00
Qua kết quả bảng 4 cho thấy mức hiệu giá kháng thể cao nhất ở 1/20 (74,07%), thấp nhất ở mức hiệu giá 1/40 (25,93%). Hiệu giá ngưng kết tập trung chủ yếu ở mức 1/20 đến 1/40, không có ngưng kết ở mức hiệu giá cao hơn. Hiệu giá kháng thể phản ánh hàm lượng kháng thể có trong máu chuột, hiệu giá càng cao chứng tỏ mức độ nhiễm xoắn khuẩn càng cao.
Hiệu giá ngưng kết tập trung ở mức 1/20 đến 1/40 cũng chứng tỏ chuột nhiễm Leptospira ở mức độ thấp. Điều này được giải thích do chuột là loài gặm nhấm mang trùng chứ không mắc bệnh. Đúng như nhận định của Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm (2007); Vũ Đình Hưng và ctv (2002) cho thấy chuột là loài vật mang trùng tự nhiên, tất cả các loài chuột đều mang và bài thải mầm bệnh qua nước tiểu.
30
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua thời gian tiến hành kiểm tra 95 mẫu huyết thanh chuột (44 mẫu chuột cống và 51 mẫu chuột đồng) bằng phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT) với kháng nguyên sống trên phiến kính, chúng tôi thu được kết quả tổng quát như sau:
Tỷ lệ dương tính chung với Leptospira trên chuột là 28,42% (27/95 mẫu). Trong đó, chuột cống nhiễm với tỷ lệ 38,64% (17/44 mẫu) và chuột đồng là 19,61% (10/51 mẫu).
Trong tổng số 27 mẫu huyết thanh dương tính với Leptospira có 14 mẫu nhiễm ghép với 2, 3, 4, 6 chủng Leptospira. Trong đó, chuột cống nhiễm ghép với 2 chủng Leptospira có tỷ lệ 17,65% (3/17 mẫu), 3 chủng 29,41% (5/17 mẫu), 4 chủng 5,88% (1/17 mẫu) và nhiễm 6 chủng với tỷ lệ 5,88% (1/17 mẫu). Ở chuột đồng nhiễm ghép với 2 chủng Leptospira là 40,00% (4/10 mẫu huyết thanh dương tính).
Hiệu giá ngưng kết ở mức 1/20 chiếm 74,07%, ở mức 1/40 chiếm 25,93%.
Từ kết quả trên cho thấy chuột ở Thành phố Cần Thơ mang mầm bệnh
Leptospira chiếm tỷ lệ khá cao. Đặc biệt là chuột cống chiếm tỷ lệ khá cao so với chuột đồng. Leptospira khu trú trong cơ thể chuột và được bài thải ra ngoài môi trường qua nước tiểu nên dễ lây nhiễm qua các loài vật nuôi và con người.
5.2 Đề nghị
Diệt chuột, phát hoang bụi rậm và sửa chữa cống rãnh để hạn chế động vật mang mầm bệnh vào khu vực chăn nuôi, khu dân cư.
Nếu có điều kiện thì nên kiểm tra với số lượng mẫu lớn hơn và ở nhiều