Nhãn được dán lên một đầu của lame với nội dung: Tên tổ chức: thận, bàng quang…
Loài: thỏ.
Ngày, tháng, năm làm tiêu bản. Đặt tiêu bản vào hộp chứa tiêu bản.
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong quá trình thực hiện tiêu bản vi thể trên thỏ, tôi đã đúc được 62 khối mẫu, có 17 khối mẫu hoàn chỉnh. Cắt và nhuộm được 337 tiêu bản và chọn được 193 tiêu bản hoàn chỉnh, trong đó: thận là 34 tiêu bản, niệu quản là 27 tiêu bản, bàng quang là 30 tiêu bản, niệu đạo là 48 tiêu bản, động mạch là 29 tiêu bản, tĩnh mạch là 25 tiêu bản.
Chất lượng tiêu bản được đánh giá theo ba mức độ:
Không đạt yêu cầu: không nhận biết được hoặc tiêu bản quá xấu, mảnh cắt dày, rách nát, gấp nếp, quá đậm màu…
Đạt yêu cầu: có thể nhận định được kết quả dù vẫn có một số lỗi nhỏ: bị xước, có phần bị bong…nhưng vẫn còn nguyên vẹn cấu trúc và màu sắc tương phản rõ ràng.
Tốt: tiêu bản cắt mỏng đều, không gấp nếp, không rách xước, màu của nhân và tế bào chất tương phản.
4.1. THẬN Hình 4.1: Tiêu bản vi thể miền vỏ thận cắt dọc (X40) Hình 4.1: Tiêu bản vi thể miền vỏ thận cắt dọc (X40) Hình 4.2: Tiêu bản vi thể miền vỏ thận cắt dọc (X10) Chùm tia tuỷ Tiểu thể thận Huyết quản Xoang Bowman Cầu mao quản Ống lượn gần
Ống lượn xa Tổ chức liên kết
Cực mạch quản
Hình 4.3: Tiêu bản vi thể của miền tuỷ thận cắt dọc (X40) Quan sát tiêu bản vi thể thận nhận thấy được:
Miền vỏ:
- Nhiều tiểu thể thận nằm lẫn với các ống dẫn niệu. - Cầu mao quản với chùm mao mạch cuộn hình khối cầu. - Các podocytes nhô ra ngoài lá tạng.
- Biểu mô lá thành là tế bào biểu mô đơn lát với tổ chức liên kết ở màng đáy.
- Cực mạch quản với động mạch ra vào.
- Ống lượn gần và ống lượn xa có cấu tạo biểu mô đơn hộp.
- Xoang Bowman là xoang nằm giữa lá thành và mặt ngoài của cầu mao quản.
- Xen kẽ với tiểu thể thận và ống dẫn niệu là các chùm tia tuỷ (tháp Ferrein)
Miền tuỷ: có các đoạn của ống dẫn niệu:
- Ống góp có cấu tạo biểu mô đơn hộp, tế bào xếp dày với nhau, thể tích lớn, bào tương sáng, nhân tròn ở giữa.
- Ống Henlé lên đường kính nhỏ hơn, tế bào xếp thưa.
- Ống Henlé xuống đường kính nhỏ, tế bào biểu mô đơn lát, lồi vào trong thành ống. Ống góp Ống Henlé lên Ống lượn xa Huyết quản Ống Henlé xuống
4.2. NIỆU QUẢN
Hình 4.4: Tiêu bản vi thể niệu quản cắt ngang (X10)
Hình 4.5: Tiêu bản vi thể của niệu quản cắt ngang (X40)
Quan sát tiêu bản vi thể niệu quản ta thấy được các lớp cấu tạo của niệu quản từ trong ra ngoài:
- Lớp biểu mô kép biến dị, trên cùng là tế bào màng láng phình to. - Lớp đệm là tổ chức liên kết với sợi chun, sợi keo bắt màu sáng.
- Lớp cơ bên dưới lớp đệm là các tế bào cơ trơn chạy dọc bên trong và chạy vòng bên ngoài.
Biểu mô phủ kép biến dị
Tổ chức liên kết
Lớp cơ trơn Lớp ngoài Tế bào màng láng Huyết quản Lớp niêm mạc Lớp cơ Lớp ngoài Huyết quản
4.3. BÀNG QUANG
Hình 4.6: Tiêu bản vi thể của bàng quang (X10)
Hình 4.7: Tiêu bản vi thể biểu mô bàng quang (X40)
Lớp niêm mạc Lớp đệm Cơ niêm Tổ chức liên kết Cơ dọc ở trong Cơ dọc ở ngoài Cơ vòng ở giữa Lớp ngoài Lớp đệm Cơ niêm Tế bào màng láng Tổ chức liên kết
Quan sát tiêu bản vi thể bàng quang ta nhận thấy được các lớp cấu tạo bàng quang từ trong ra ngoài:
- Lớp biểu mô kép biến dị và bên trên cùng là lớp tế bào màng láng. - Lớp đệm bên dưới biểu mô là tổ chức liên kết. Tầng cơ nêm mỏng. - Lớp cơ: lớp cơ dọc bên trong, lớp cơ vòng ở giữa và cơ dọc ở ngoài. - Bên ngoài là tổ chức liên kết.
4.4. NIỆU ĐẠO
Hình 4.8: Tiêu bản vi thể niệu đạo phần dương vật (X10)
Lớp hải miên Lớp màng trắng Tuyến Huyết quản Biểu mô phủ kép biến dị Huyết quản Tổ chức liên kết Sợi chun Tuyến Cơ trơn Lớp niêm mạc
Quan sát tiêu bản vi thể niệu đạo phần dương vật từ trong ra ngoài ta thấy:
Lớp niêm mạc: biểu mô phủ kép biến dị. Lớp đệm dày mỏng không đều với sợi chun, sợi keo và mạch quản.
Lớp hải miên với nhiều vách ngăn, có cơ trơn chạy dọc. Tổ chức liên kết bao quanh lớp hải miên.
4.5. ĐỘNG MẠCH
Hình 4.10: Tiêu bản vi thể động mạch lớn cắt ngang (X40)
Hình 4.11: Tiêu bản vi thể động mạch nhỏ cắt ngang (X40)
Áo trong Áo giữa
Phiến chun ngoài Huyết quản Cơ vòng xen lẫn phiến chun Tổ chức liên kết
Biểu mô đơn lát
Áo ngoài
Phiến chun trong
Áo ngoài Cơ trơn
Tổ chức liên kết Áo giữa Biểu mô đơn lát
Quan sát tiêu bản vi thể động mạch ta thấy thành động mạch có ba lớp: Lớp áo trong với tế bào biểu mô đơn lát, dưới niêm mạc có tổ chức liên kết với ít sợi chun.
Lớp giới hạn trong được tạo bởi phiến chun dày, trong suốt, trải khắp mặt trong động mạch, bắt màu tương tự như phiến chun ở áo giữa.
Lớp áo giữa là những phiến chun dợn sóng xen lẫn với sọi cơ. Động mạch lớn có áo giữa dày, những phiến chun xếp đồng tâm chiếm ưu thế. Động mạch nhỏ thì áo giữa chủ yếu là những sợi cơ trơn.
Lớp giới hạn ngoài được tạo bởi nhiều sợi chun dày xếp chặt với nhau tạo thành phiến chun ngoài trong suốt, phân biệt giữa áo giữa và áo ngoài.
Áo ngoài là tổ chức liên kết chứa mạch quản, có ít sợi chun, sợi keo ở động mạch lớn. Ở động mạch nhỏ là tổ chức liên kết mỏng.
4.6. TĨNH MẠCH
Hình 4.12: Tiêu bản vi thể tĩnh mạch (X40)
Quan sát tiêu bản vi thể tĩnh mạch ta thấy các lớp cấu tạo tĩnh mạch: Áo trong mỏng hơn ở động mạch, có biêu mô đơn lát, nhân lồi vào lòng ống. Van tĩnh mạch do áo trong và tổ chức liên kết tạo thành.
Áo giữa có ít sợi cơ trơn cùng với tổ chức liên kết là sợi keo và sợi chun.
Áo trong Áo giữa Áo ngoài Tổ chức liên kết Van tĩnh mạch Hồng cầu Biểu mô phủ lát đơn Cơ trơn
Một số nguyên nhân làm tiêu bản không đạt yêu cầu
Tiêu bản bị rách: do dao không sắc, mẻ, dơ; do nhiệt độ nước trong chậu tải không đủ nóng, kỹ thuật tải mẫu chưa tốt.
Tiêu bản bị gấp nếp: nhiệt độ nước trong chậu tải không đủ nóng, kỹ thuật tải mẫu chưa thành thạo.
Tiêu bản bị sọc: do dao dơ, tốc độ cắt không đều.
Tiêu bản không ăn màu tương phản giữa nhân và tế bào chất: thời gian nhuộm tiêu bản chưa thích hợp,
Một số lƣu ý khi thực hiện tiêu bản
Tuỳ vào tổ chức mà có thời gian ngâm hoá chất khác nhau:
Formol: đối với những mẫu có tổ chức dai và dày thì thời gian ngâm lâu hơn bình thường. Ta có thể ngâm từ 24-48 giờ.
Xylene: những mẫu có tổ chức dai và dày thì thời gian ngâm mẫu lâu hơn bình thường. Ta có thể ngâm hơn 90-100 phút, lúc này xylene mới ngấm hoàn toàn vào tổ chức và loại bỏ hết cồn.
Ở giai đoạn khử nước có thể ngâm mẫu trong cồn 700 đến 12 giờ.
Ở giai đoạn lọc paraffin: paraffin có lẫn nhiều tạp chất nên phải lọc nhiều lần, lọc càng nhiều paraffin càng tinh khiết thì càng dễ loại xylene ra khỏi mẫu. Mặt khác, khi đúc mẫu, paraffin sẽ trong và không bị nứt hoặc vỡ.
Khi tẩm paraffin nên chọn paraffin non. Do tinh thể paraffin non nhỏ hơn của paraffin già nên dễ ngấm vào tổ chức hơn.
Giai đoạn nhuộm mẫu: các tổ chức khác nhau bắt màu khác nhau. Tuỳ theo tổ chức mà có thời gian nhuộm khác nhau, không nhất thiết phải giống trong quy trình nhuộm.
Nếu tiêu bản bắt màu nhạt nên tăng thời gian ngâm Hematoxylin hoặc Eosin sao cho tiêu bản mẫu có độ tương phản rõ nhất. Đối với Hematoxylin thì thời gian ngâm khoảng từ 1 phút 30 giây đến 2 phút. Đối với Eosin thì ngâm từ 15-18 phút.
Nếu tiêu bản không ăn màu thuốc nhuộm thì phải kiểm tra phẩm chất thuốc nhuộm, do thuốc nhuộm đã dùng ngâm nhiều mẫu nên đã bị pha lẫn với hoá chất khác hoặc do hoá chất đã cũ nên bị biến chất. Có thể bổ sung thêm acid acetic vào Eosin để tăng tính ăn màu của mẫu. Cần phải theo dõi và thường xuyên thay hoá chất nhưng tránh lãng phí. Trung bình nhuộm khoảng 50-70 lame nên thay hoá chất một lần.
Ƣu và khuyết điểm của quá trình thực hiện tiêu bản Ƣu điểm
Quy trình đơn giản, dễ thực hiện.
Mẫu bắt màu tốt, có sự tương phản màu rõ rệt: nhân màu xanh đen, tế bào chất màu đỏ hồng.
Các lớp tổ chức có thể được phân biệt dưới kính hiển vi.
Khuyết điểm
Thiếu một số thiết bị, máy móc làm mất nhiều thời gian khi thực hiện thủ công.
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
Bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép Hematoxylin và Eosin Y, các mục tiêu của đề tài “Thực hiện tiêu bản mô động vật: thận, niệu quản, bàng quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch trên thỏ” đã được thực hiện hoàn chỉnh.
Đã khảo sát và đọc được tiêu bản vi thể cố định của mô thận, niệu quản, bàng quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch trên thỏ.
Đã thực hiện được thành thạo các bước trong quy trình thực hiện tiêu bản.
Tiêu bản làm ra đáp ứng được yêu cầu, phục vụ cho học tập, nghiên cứu và giảng dạy.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Thực hiện tiêu bản của cùng cơ quan trên các loài động vật khác để so sánh sự giống và khác nhau.
Trang bị lại thiết bị, máy móc cần thiết đã bị hư để thao tác làm tiêu bản thuận lợi và nhanh hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lâm Thị Thu Hương. 2005. Mô phôi gia súc. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
2. Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh. 2001. Sinh lý học người và động vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật hà Nội.
3. Lê Hoàng Sĩ và Phan Ngọc Anh. 2000. Tổ chức học động vật. Đại học Cần Thơ.
4. Vũ Công Hoè. 1967. Kỹ thuật hiển vi thông thường. NXB Y học Hà Nội.
5. Phan Thanh Trúc. 2010. Thực hiện một số tiêu bản: hạch màng treo ruột, bàng quang, dịch hoàn, mào tinh và tuyến mang tai trên thỏ. Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ.
6. Phan Văn Khải. 2013. Thưc hiện tiêu bản mô động vật: tuyến giáp trạng, lách, hạch lâm ba ruột, buồng trứng trên thỏ, tuỵ tạng trên vịt, Fabricius trên gà. Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ.
7. Mariano S.H.D Fiore. 1974. Atlas of Human Histology. Leu & Febger Philadenphia.
8. Hệ tiết niệu Mô học - Ykhoaonline http://ykhoaonline.com/y-hoc-co- so/mo-hoc/he-tiet-nieu-mo-hoc/#ixzz32Qz14QJy
9. Hệ tuần hoàn mô học - Ykhoaonline http://ykhoaonline.com/y-hoc-co- so/mo-hoc/he-tuan-hoan-mo-hoc/#ixzz32QzWxUfM
10.Hệ tiết niệu – http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/corepages /urinary/urinary.htm
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ THẬN
Hình A.1: Tiêu bản vi thể miền vỏ thận (X10)
Hình A.3: Tiêu bản vi thể miền tuỷ thận (X10)
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ CỦA NIỆU QUẢN
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ CỦA BÀNG QUANG
Hình A.7: Tiêu bản vi thể bàng quang (X4)
Hình A.8: Tiêu bản vi thể bàng quang (X10)
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ NIỆU ĐẠO
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ CỦA ĐỘNG MẠCH
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VI THỂ TĨNH MẠCH
PHỤ LỤC B
Bảng B.1: Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi đúc mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Block vỡ có nhiều hạt
Paraffin xấu, không tinh khiết
Thay và lọc thật kỹ paraffin
Mẫu bật ra khỏi block khi cắt, trong block có khí
Thao tác đúc khuôn chậm
Đúc lại mẫu, thao tác nhanh hơn
Mẫu khó cắt hay vỡ ra từng mảnh
Paraffin quá cứng Thay paraffin khác mềm hơn Tổ chức bị co rúm lại Nhiệt độ tẩm Paraffin cao hơn 65oC Loại bỏ mẫu đó Khó cắt, tổ chức bị tước xơ
Paraffin chưa thấm hoàn toàn vào tổ chức, chưa loại hết cồn và xylene
Tẩm lại paraffin lâu hơn, hoặc loại bỏ mẫu đó nếu có mẫu dự trữ
Bảng B.2: Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi cắt mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Các mảnh cắt có độ dài không bằng nhau
Điều chỉnh máy cắt với tốc độ không thích hợp
Tăng hoặc giảm tốc độ quay máy cắt. Điều chỉnh độ dày, mỏng của máy cắt và độ nghiêng lưỡi dao
Mảnh cắt bị cuộn lại không xếp thành băng
Mặt trên, dưới của khuôn mẫu và lưỡi dao không song song nhau
Điều chỉnh khuôn mẫu cho mặt cắt song song lưỡi dao
Mảnh cắt bị rách, thủng
Dao cắt bị lục, mẻ, dơ Lau sạch lưỡi dao hoặc thay lưỡi dao mới Mẫu bị nứt, vụn
nát
Mẫu còn nước, nhiệt độ paraffin lúc tẩm quá cao, tốc độ tay quay không phù hợp
Chú ý nồng độ và thời gian ngâm cồn và nhiệt độ tủ sấy lúc tẩm paraffin Mảnh cắt bị vết răng cưa và dính vào dao Paraffin mềm, nhiệt độ phòng quá nóng
Cắt dày hơn, điều chỉnh nhiệt độ của máy lạnh xuống
Mảnh cắt dính lại trên khuôn mẫu
Dao dơ, độ nghiêng của dao chưa đủ
Thay dao mới, kiêm tra độ nghiêng của dao
Bảng B.3: Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi tải, hấp và nhuộm mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Mẫu bị gấp nếp Nước trong châu tải không đủ nóng
Tăng nhiệt độ trong chậu tải
Mẫu bị rách Nhiệt độ nước quá cao Giảm nhiệt độ chậu tải bằng cách thêm nước lạnh vào
Bị tuột mẫu trong lúc nhuộm
Mạnh tay trong lúc nhuộm
Thao tác nhuộm phải châm, nhẹ nhàng
Công thức pha chế Formol trung tính 10%
- Formalin (37-40%) 100 ml - Nước cất 900 ml - Sodium phosphate monobasie 4 g - Sodium phosphate dibasie 6,5 g
Cách pha thuốc nhuộm trong kỹ thuật nhuộm kép (Hematoxylin và Eosin Y)
Thuốc nhuộm Hematoxylin
- Tinh thể Hematoxylin 5 g - Cồn tuyệt đối 50 ml - Phèn chua 100 g - Nước cất 1000 ml - Moreuride oxide 2,5 g
Cách pha chế Hematoxylin theo Harris
Hoà tan Hematoxylin trong cồn và phèn chua trong nước cất đun sôi, mang ra khỏi bếp và trộn hai dung dịch lại.
Đun sôi nhanh không quá một phút, luôn khuấy đều, tắt lửa rồi cho Moreuride oxide vào từ từ, khuấy đều, đun nhỏ lửa cho đến khi dung dịch có màu tím đậm.
Mang ra khỏi bếp và cho vào nước lạnh để làm lạnh nhanh, khi dung dịch nguội lại rồi lọc trước khi dùng.
vào nước ấm. Nếu thấy giọt phẩm nhuộm có màu đỏ một lúc sau mới chuyển sang màu tím xanh là phẩm nhuộm đã loãng và biến chất, phải loại bỏ. Nếu giọt phẩm nhuộm có màu tím xanh ngay là còn sử dụng được.
Thuốc nhuộm Eosin Y
Eosin dự trữ:
- Eosin Y 4 g - Nước cất 20 ml - Hoà tan thêm cồn 80 ml Eosin nhuộm:
- Eosin dự trữ 1 phần - Cồn 800 2 phần
Hoà tan vào nhau và cho thêm 0,5ml acid acetic đậm đặc cho 100 ml dung dịch trước khi dùng.