Cồn có độ hoà tan paraffin thấp nên cần có dung dịch hoà tan paraffin cao hơn và tan trong cồn để paraffin ngấm vào tổ chức hoàn toàn, dung dịch trung gian là xylene. Xylene loại cồn trong mẫu, làm tan paraffin để paraffin dễ dàng ngấm vào và làm trong mẫu. Tuy nhiên, xylene có thể làm cứng mẫu nếu ngâm mẫu quá lâu.
Ngâm mẫu qua 2 lọ xylene, mỗi lọ ngâm trong 45 phút. Ngoài xylene, ta có thể sử dụng benzene, chloroform, toluene hoặc dầu thông nhưng có hạn chế khi sử dụng do benzene rất độc, chloroform ngấm chậm và làm trong mẫu kém, toluene và dầu thông thì rất hiếm.
3.2.7 Tẩm paraffin
Mục đích của công đoạn này giúp cắt mẫu thành những lát cắt mỏng có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Lát cắt càng mỏng thì số lớp tế bào càng ít giúp chúng ta quan sát cấu trúc tổ chức dễ dàng hơn. Do đó, ta cần phải tẩm paraffin vì sự cố định mẫu chỉ mới giết tế bào và giữ cho những thành phần tế bào bất động trong tình trạng tĩnh. Việc tẩm paraffin là tạo nền cho mẫu, vừa như khuôn giữ vững mẫu vừa thâm nhập vào gian bào giữ cho thành phần tế bào được giữ yên khi cắt mỏng.
Cần chọn loại paraffin thích hợp tan trong các dung môi trung gian. Paraffin thuần khiết là loại đặc, chắc, trắng đục, óng ánh, nóng chảy đều, dẻo và dễ cắt. Paraffin xấu là loại không thuần khiết, có nhiều bọt khí, tinh thể to, nóng chảy không đều, giòn khi cắt và có màu ngả vàng. Paraffin thích hợp nhất có điểm nóng chảy khoảng 56-580C. Không nên trộn paraffin thừa vào nhau sẽ làm paraffin không thuần khiết. Paraffin chỉ có thể ngấm hoàn toàn vào mẫu và loại xylene ra khỏi mẫu khi nó ở trạng thái lỏng trong suốt quá trình tẩm, vì thế giai đoạn tẩm paraffin phải được tiến hành trong tủ sấy.
Chuyển mẫu từ lọ xylene cuối vào các cốc chứa paraffin lỏng đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C. Chuyển mẫu qua hai cốc paraffin khác nhau, mỗi cốc tẩm trong 2 giờ.
3.2.8 Đúc khuôn
3.2.8.1 Chuẩn bị
Thanh kim loại và bản kim loại. Xếp các thanh kim loại gãy góc xếp thành hình chữ nhật có kích thước theo ý muốn.
Đèn cồn, kẹp gắn mẫu.
3.2.8.1 Tiến hành
Lấy lọ paraffin đang lỏng đổ vào khuôn. Dùng kẹp hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn, gắp mẫu vào khuôn và định vị cấu trúc không gian của mẫu. Sau 15 phút, ta tách khối paraffin ra khỏi khuôn kim loại và đúc mẫu khác.
Dán nhãn, kí hiệu mẫu vào khối mẫu, 24 giờ sau mới có thể tiến hành cắt mẫu.
3.2.9 Cắt mẫu
Chuẩn bị dao cắt mẫu. Lưỡi dao phải sắc, không răng cưa, dơ bẩn vì có thể gây hư tổn cho lát cắt, làm tổ chức bị rách nát, biến dạng…
Trước khi cắt mẫu cần kiểm tra máy cắt cẩn thận. Gắn dao lên máy cắt nghiêng khoảng 150-200. Gắn mẫu lên trục mang mẫu, siết chặt ốc. Định hướng khối mẫu và dao trên máy cắt cho thích hợp. Hai mặt trên và dưới của khối mẫu phải song song nhau thì mảnh cắt sẽ thành dãy liên tục. Điều chỉnh ốc vi cấp của máy cắt, cắt thử mẫu ở độ dày 10 µm. Sau đó giảm dần đến khoảng 3-5 µm.
3.2.10. Tải – hấp mẫu
Chuẩn bị lame sạch, kim mũi giáo và dùng nước ấm khoảng 41-420C cho vào chậu thuỷ tinh. Mục đích là làm căng mẫu từ từ. Chú ý nếu nhiệt độ nước quá cao thì mẫu dễ tải nhưng khi bị gấp nếp sẽ khó can thiệp vì paraffin sẽ dính chặt vào kim mũi giáo, nếu nước không đủ nóng thì mẫu ít căng.
Dùng kim mũi giáo đỡ mẫu vừa cắt được cho vào chậu nước ấm, tách mẫu từ dãy băng cho rời ra. Chọn mẫu không bị rách, gấp nếp và có độ dày thích hợp. Nếu mẫu bị gấp nếp thì dùng tay tỳ một bên nếp gấp, bên còn lại dùng kim mũi giáo tách nhẹ ra. Thao tác phải nhẹ nhàng nếu không sẽ dẫn đến rách mẫu.
Khi paraffin đã căng, lấy lame nghiêng nhẹ vớt mẫu, đặt mẫu sao cho ở giữa lame. Thời gian tải mẫu phải nhanh để tránh sự tiếp xúc của tổ chức với nước sẽ làm cho tế bào trương phồng thì mẫu sẽ khó bắt màu, nhân tế bào sẽ biến đổi hình dạng.
3.2.11 Nhuộm mẫu
Chuẩn bị 5 lọ xylene, 5 lọ cồn tuyệt đối, 2 lọ cồn 900, 2 lọ cồn 800, 1 lọ cồn 700, 1 lọ Hematoxylin, 1 lọ Eosin Y, 2 lọ nước cất, giấy thấm.
Quy trình nhuộm mẫu được thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.2: Quy trình nhuộm mẫu
Cho lame từ tủ hấp lần lượt vào các lọ xylene 1, xylene 2 nhằm loại paraffin.
Ngâm mẫu trong cồn có nồng độ giảm dần 1000, 900, 800 để rút xylene ra khỏi mẫu.
Rửa nước lại để loại cồn trong mẫu. Hematoxylin để nhuộm nhân.
Ngâm lame vào nước 10 phút để rửa sạch mẫu. Eosin nhuộm tế bào chất.
Nhúng qua cồn 700, 800, 900, 1000 để loại hết màu dự trữ, khử nước và rửa bớt Eosin thừa trong mẫu.
Ngâm xylene để loại hết cồn trong mẫu.
Khi chuyển lame từ lọ nhuộmnày sang lọ nhuộm khác phải lau qua giấy
thấm nhằm hạn chế trộn hoá chất trộn lẫn với nhau. Thao tác chuyển lame
phải nhẹ nhàng, tránh làm rớt mẫu khỏi lame.
3.2.12 Dán lamelle – dán nhãn
