3 RM418 TCGCGTATCGTCATGCATAG GAGCACAT ATGCCAC GTACG 4RM21560CCGTGCTTT GA ATT G ACT
2.3.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính
♦♦♦ Chuẩn bị kỉnh
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X. Để 5 phút cho khô dung dịch.
Chủ ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.
- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) được tạo thành bằng cách thêm 2 (J.1 Bind Silane vào 1 ml chứa 95% ethanol và 5%
glacial acetic acid.
- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.
- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4 mm.
♦♦♦ Chuẩn bị gel polyacrylamide
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380 g; bisacrylamide 20 g pha trong 1 lít nước).
- Đổ 60 ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6 ml TBE ÌOX: 6,75 ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100 ml. Thêm 300 |J,1 10% APS (ammonium persulfate) và 60 |J,1 TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.
- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. - Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng
kẹp cố định lược.
- Để gel polyme hóa trong 1-2 giờ. ❖ Điện di
- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE IX vào buồng đệm trên và dưới. - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.
- Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60 A, công suất
92-100 w.
- Biến tính các sản phẩm PCR ở 95°c trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.
- Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4 ịú Sequencing Stop solution (10 mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).
- Tra vào mỗi giếng 5 Ị4.1 sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.
- Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60 w và ở 50°c, thời gian chạy ngắn hay
dài tùy kích thước từng mồi sử dụng. + Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100 ml glacial acetic acid và 900 ml nước cất.
- Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1 g bạc nitrat (AgN03) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5 ml formaldehyd (H2CO) 37%.
- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30 g natri cacbonat (Na2C03) trong 1 lít nước cất và làm lanh ở -20°c.
Chú ý. (Trước khi sử dụng thêm 1,5 ml formaldehyde (H2CO) 37% và 200 Ị4.1 natri thiosulfat 10% (Na2S20.5H20).
+ Tiến hành nhuộm
Sau khi chạy điện di, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau: - Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên,
đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý: Giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau.
- Rửa gel bằng nước cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm íòrmaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5-10 giây.
- Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3-6 phút. Rửa lại gel bằng nước cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.