2.2.1 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imỉpenem trong huyết tương.
- Pha dãy dung dịch imipenem chuẩn .
Cân chính xác khoảng 500g Imipenem chuẩn pha thành 25ml trong bình định mức bằng nước cất siêu sạch ta sẽ được dung dịch Imipenem chuẩn với nồng độ 20|ig/10|ul(C]).Từ C| tiến hành pha loãng bằng MES thành các dung dịch c2; c3; C4; C5 Vơí các nồng độ tương ứng như sau: 10,0;5,0; 1,0; 0,1 |ig /1 0 |jl Cách pha như sau:
Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch Imipenem chuẩn
MES 0,5M c , c 2 c3 c 4
c 2 2501 |ul 250|Lil
c 3 250|il 250^1
Q 400|Lil lOOịlll
Q 450|lx1 50fil
Sau đó tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích theo sơ đồ sau: Như vậy khi thêm 10/71 các chuẩn Q ; C2;C3;C4; C5 Vào các 5 ống nghiệm chứa Iml huyết tương ta sẽ lần kượt có các mẫu thử với nồng độ tương ứng là:20; 10; 5,0; 1,0; 0,1 ng/lm l .Tiến hành xử lý mẫu theo hình 2.1..
2.2.1.1. Lựa chọn cột chạy sắc ký
Qua nghiên cứu trên nhiều tài liệu và điều kiện hiện có chúng tôi đã sử dụng cột Novapak C I8 (4,6mm X 150mm) đường kính hạt 5|j,m để nghiên cứu.
2.2.1.2. Lựa chọn thành phần pha động.
- Thêm 10|Lil imipenem nồng độ 20 |ug/ml vào l,0m l huyết tương + 1,0 ml MES; Xử lý mẫu theo hình 2.1 sau đó tiến hành chạy sắc ký với thành phần pha động như sau:
- Cân Acid 6,183g acid boric 0,2M pha thành 500ml trong bình định mức. Phối hợp với MeOH theo tỷ lệ như bảng 2.2 rồi điều chỉnh đến pH 7,2 bằng NaOH 0,1M rồi lọc qua màng lọc 0,45|um; Siêu âm trong 30 phút rồi tiến hành chạy sắc ký. Kết quả thu được như sau:
Bảng 2.2. Khảo sát thành phần pha động
MeOH Acid boric Thời gian lưu( TR) Nhận xét
10 90 Khoảng 2-3 phút Pic xuất hiện quá sớm .Pic của Imipenem và các thành
phần khác trong huyết tương tách không rõ ràng
5 95 3,8-5,0 phút Tách tốt
3 97 6 phút trở lên Pic xuất hiện chậm
*Nhận xét: Qua quá trình khảo sát lựa chọn pha động chúng tôi đã lựa chọn pha động : Acid boric : Methanol ( 95 : 5 ) là tốt nhất cho quá trình thực nghiệm.
2.2.I.3. Lựa chọn tốc độ dòng.
- Chuẩn bị mẫu phân tích có chứa imipenem chuẩn với nồng độ nồng độ 20 |j,g/ml vào lm l huyết tương + 1,0 ml MES; x ử lý mẫu theo hình 1 sau đó tiến hành chạy sắc ký với tốc độ dòng như sau:
Bảng 2.3: Khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ dòng (ml/phút)
ựphút) Nhận xét
0.6 2,232 Píc của chất thử và huyết tương tách không rõ ràng.
0,8 4,142 Píc tách tốt. Áp suất cột vừa phải
*Nhận xét: Với tốc độ dòng 0,8ml/phút pic của imipenem tách hoàn toàn ra khỏi các thàn phân khác của huyết tương, thời gian lưu hợp lý (tr=4,142 phút).Chúng tôi quyết định lựa chọn tốc độ dòng là 0,8ml/phút.
2.3.4 Lựa chọn bước sóng.
Để xác định bước sóng cho định lượng, chúng tôi đã tiến hành quét phổ hấp thụ UV-VIS cảu dung dịch imipenem 0,05% trong khoảng 190 - 400nm . Kết quả cho thấy dung dịch có cực đại hấp thụ của là À,max=298nrn. Chúng tôi quyết định lựa chọn nghiên cứu ở bước sóng 298nm.
Kết luân: Sau quá trình khảo sát, chúng tôi quyết định lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng imipenem trong huyết tương như sau:
+ Cột sắc ký: Novapak Cịg ( 4,6mm X 15cm ) đường kính hạt 5 // m. + Pha động: Acid boric 0,2M : MeOH (95 : 5)
+ Bước sóng: 298nm + Tốc độ dòng: 0.8ml/phút + Thể tích tiêm: 50 /í 1
Trong điều kiện sắc ký đã xác định chúng tôi đã tiến hành chạy thử với nồng độ Imipenem trong huyết tương là:20|ug/ml. sắc ký đồ thu được như sau:
Minutes
Hình 2.3: Pic của Imipenem chạy trong điều kiện sắc ký đà xác định *Nhận xét:
Pic của imipenem thu được cân đối, gọn, tách riêng biệt với các thành phần khác, thời gian lưu hợp lý (tr=4,458phút).
2.2.2. Thẩm định phương pháp sắc ký
2.2.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp
Chúng tôi tiến hành pha imipenem với nồng độ là: 0,1; 1,0; 5,0; 10; 20 Hg/lml . Xử lý mẫu như hình 2.1 rồi tiến hành chạy sắc ký. ơ mỗi nồng độ tiến hành làm 5 mẫu.Từ diện tích pic thu được xác định phương trình quy hồi tuyến tính biểu thị sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của Imipenem trong huyết tương.
Bảng 2.4: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của Imipenem trong hưyết tương
Mẫu Diện tích pic của mẫu có nồng độ (|Lig/ml) tương ứng
0,l(|ug/ml) l,0(|ig/m l) 5,0(|ig/ml) 10(|ig/ml) 20(|ig/ml)
1 13251 147528 731479 1396642 2712317 2 13098 145890 728456 1336214 2652113 3 12932 146365 743873 1426383 2741298 4 13342 148213 742135 1483253 2732564 5 12842 146421 715366 1346322 2701341 <ết quả thống kê x tb= 13093 Xtb=146883 Xlb= 732261 x tb= 1397762 x tb= 2707926,6 RSD=1,49% RSD =0,54 RSD%=1,64 RSD =3,52% RSD% =1,4 s =194,8 s =792,6 s =12046 s = 49175 s =37821,7 s =1,85% 8 =0,67% £ =2,04% s =4,37% 8=1,7% sx =87,1 s x =354 sx =5387,5 sx = 21992 Sx = 16914,4
Phương trình hồi quy: y =134714 X + 23888 Hệ số tương quan: r = 0,9997
Hình2. 4: Đ ồ thị biểu diễn sự phụ thuộcdiện tích pic và nồng độ imipenem trong huyết tương
*Nhận xét:
Như vậy, nồng độ imipenem và diện tích pic có tương quan rất chặt chẽ (r=0,9997) trong khoảng nồng độ khảo sát 0,1 |Lig/ml đến 20|uig/ml. Điều kiện sắc ký đã xây dựng đảm bảo định lượng imipenem có khoảng dao động về nồng độ lớn. Điều này đặc biệt quan trọng trong định lượng imipenem trong huyết tương người bệnh.
22.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp
Chuẩn bị mẫu thử là huyết tương trắng của người có chứa imipenem chuẩn ở các nồng độ 1; 5; 10 (n-g/ml) . Tiến hành xử lý mẫu theo sơ đồ hình 2.1 và sắc ký theo điều kiện đã xác định.
Chuẩn bị mẫu chuẩn là các dung dịch imipenem chuẩn trong pha động ở các nồng độ như phần chuẩn bị mẫu huyết tương trắng để xác định độ tìm lại trong huyết tương người. Tiến hành sắc ký theo điều kiên đã khảo s á t .
Độ tìm lại của imipenem trong mẫu thử huyết tương người là phần trăm giá trị đáp ứng của imipenem trong huyết tương và trong pha động.
Bảng.2.5: Xác định độ đúng của phương pháp
STT Tỷ lệ diện tích pic Imipenem trong huyết tương và trong pha động
l|Lig/ml 5|0,g/ml 10ụ.g/ml
HT Pha động HT Pha động HT Pha động
1 146735 144243 730876 726879 1336214 1302342 2 145890 145354 741109 729974 1396642 1258532 3 147265 146365 730987 731008 1386211 1334573 4 149345 141832 729749 723674 1386515 1357235 5 147528 145237 729756 721812 1426383 1256332 x tb 147352,6 144606,2 732495,4 726669,4 1386413 1301802,8 s 1277,57 1723,3 4851.25 3948,2 45945,7 40216,5 RSD% 0,87% 1,20% 0,66% 0,54% 3,31% 3.08% % Tìm lại 98,,1% 99,2% 94-,1% *Nhận xét: Tại nồng độ l|0.g/ml có độ đúng 98.1%; Nồng độ 5|ng/ml có độ đúng 99.2%; Nồng độ 10 I^g/ml có độ đúng 94,1%. Điều đó chứng tỏ phương pháp có độ đúng tốt có thể áp dụng thực nghiệm để xác định nồng độ imipenem trong huyết tương.
2.2.2.3 Khảo sát độ chính xác của phương pháp
Trong đánh giá độ chính xác của phương pháp chúng tôi chọn chỉ tiêu đánh giá độ lặp lại của diện tích pic và thời gian lưu của imipenem trong huyết tương.
Chuẩn bị mẫu thử là huyết tương trắng của người có chứa imipenem chuẩn ở các nồng độ l,0|Lig/ml và 10 |0.g/ml. Tiến hành xử lý mẫu theo sơ đồ hình 2.1 và sắc ký theo điều kiện đã xác định. Khảo sát độ lặp lại của diện tích pic và thời gian lưu bằng cách xử lý 5 mẫu của mỗi nồng độ trên.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp th ể hiện qua sự lặp lại của diện tích pic
Mẫu Diện tích pic của mẫu có
nồng độ l,0|ig/m l
Kết quả thống kê Diện tích pic Của mẫu có nồng độ 10ng/ml Kết quả thống kê 1 148768 s = 1878,9 1420932 s =42884,4 2 147234 1335742 3 144435 RSD% = 1,27% 1363632 RSD% = 3,14% 4 146375 1315365 5 149008 sx= 840,2 1395323 s x=191 8 6 , 2 stb 147164 e% = 1,58% 1366198,8 8 - 3,89%
Bảng 2.7. Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp th ể hiện qua sự lặp lại của thời gian lưu.
Mẫu Thời gian lưu (phút) của mẫu có nồng
độ l,0|dg/ml
Kết qủa thống kê Thời gian lưu (phút) của mẫu có nồng độ 10|j,g/ml Kết qủa thống kê 1 4,138 8 =3,26 s x =48,8 s =10,9 RSD% =2,63% x tb= 4,154 4,237 8 — 1,4% s x = 2 1 , 0 s = 4,8 RSD% =1,13% x,b= 4,269 2 4.005 4,321 3 4,257 4,325 4 4,163 4,185 5 4,206 4,275 *Nhận xét:
Kết quả cho thấy :Tại nồng độ l,0|j,g/ml diện tích pic có RSD% = 1,27, thời gian lưu có RSD% = 2,63;Tại nồng độ 10|LXg/ml diện tích pic có RSD% = 3,14%, thời gian lưu có RSD% = 1,4%. Điều đó chứng tỏ phương pháp sắc ký có độ lặp lại cao.
2.2.2.4 Giới hạn định lượng.
Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng của người thêm Imipenem chuẩn có nồng độ thấp dần để được mẫu thử có nồng độ 0,01;0,02;0,04 |J,g/ml. Mỗi nồng độ làm 3 mẫu. x ử lý mẫu theo hình 2.1 và tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát.Kết quả được trình bày ở bảng 2.8
Bảng 2.8: Xác dịnh giới hạn định lượng củaimipenem
Mẫu Diện tích pic thu được ứng vơí các nồng độ khảo sát 0,01 ỊL-ig/ml 0,02ụ.g/ml 0,04|ug/ml 1 1253 3765 7342 2 1974 3365 7598 3 1462 2998 7098 xtb 1563 3376 7346 s 370,96 383,5 315,88 RSD% 23,73% 11,36% 4,43% *Nhận xét:
Qua kết quả phân tích cho thấy với nồng độ 0.01|ag/ml RSD % = 23,73% giá trị này lớn hơn 20%.Trong khi đó tại nồng độ 0,02|ag/ml RSD% = 11,36% nhỏ hơn 20%. Như vậy giới hạn định lượng của phương pháp là : 0,02|ig/ml.Với giới hạn định lượng này hoàn toàn có thể áp dụng để định lượng imipenem trong huyết tương bệnh nhân.
2.2.2.5 Tính đặc hiệu của phương pháp
Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi đã tiến hành như sau: - Mẫu 1 : 1,0 ml huyết tương + 1,0ml MES sau đó xử lý mẫu như hình 2.1, chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát.
- Mãu 2: Hút 10jul Imipenem chuẩn nồng độ 20jug/10)Lil vào ống teflon chứa 1,0ml huyết tương + 1,0 ml MES sau đó tiếp tục xử lý theo sơ đồ hình 2.1 để chạy sắc ký.
1500 H 1000- 500 - h 1500 1000 ■500 Hînh 2. 5: Mâu 1 Minutes Hînh 2 .6 : Mâu 2
*Nhận xét:
Sắc ký đồ ở hình 2.5 (huyết tương không có imipenem) cho thấy tại thời gian từ 4 phút cho đến 5 phút không có pic.Trong khi đó tại thời diểm 4,208 phút của mẫu có imipenem, xuất hiện pic rõ ràng cân đối. Điều đó chứng tỏ phương pháp được xây dựng trên có tính đặc hiệu cho phân tích Imipenem trong huyết tương .
* Kết luận
Qua quá trình thẩm định phương pháp chúng tôi nhận thấy phương pháp có độ đúng cao: + Nồng độ l|ig/m l có độ tìm lại: 98,1%. + Nồng độ 5,0|ig/ml có độ tìm lại: 99,2%. + Nồng độ 10,0|j.g/ml có độ tìm lại: 94,1%. Độ chính xác cao: + Nồng độ l|ig/m l có RSD% = 1,27%. + Nồng độ 10|Lig/ml có RSD% = 3,14%.
Tính đặc hiệu tốt, khoảng nồng độ tuyến tính rộng (0.1 - 20|Lig/ml), giới hạn định lượng cao 0,02|ig/ml. Như vậy phương pháp đã xây dựng có thể ứng dụng để định lượng imipenem trong huyết tương người.
2.2.3 ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng
im ipenem trong huyết tương bệnh nhân sau khi tiêm truyền Tienam 500mg.
Lấy máu của bệnh nhân có truyền Tienam500mg ở bệnh viện Bạch Mai và tiến hành xử lý mẫu theo sơ đồ hình 2.2 và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Qúa trình lấy máu như sau:
Bệnh nhân X đang được điều trị bằng Tienam500mg. Bệnh nhân được chỉ định dùng thước vào buổi sáng vào khoảng 6h. Chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu tại 5 thời điểm: Ogiờ; 1 giờ; 4giờ; 6giờ và 8giờ (tính từ thời điểm 6 giờ sáng.
Dưới đây là pic của Imipenem thu của mẫu được tại thời điểm 1 giờ và 4 giờ:
Minutes
Hình 2.7. Sắc ký đồ của imipenem trong huyết tương bệnh nhân tại thời điêm 1 giờ
Minutes
Hình 2.8: sắc kỷ đồ của imipenem trong huyết tương bệnh nhân tại thời điểm 4 giờ
Bảng 2.9: Kết quả định lượg Imipenem trong huỵêí tươnạ bệnh nhân
Mẫu phân tích tích lấy tại thời điểm l giờ Mẫu phân tích tích lấy tại thời điểm 4 giờ Diên tích pic Nồng độ Imipenem Diên tích pic Nồng độ
Imipenem 766935 5,52 |Lig/ml 700198 5,02|Lig/ml 743722 5,34 |ig/ml 729327 5,24ịig/ml 779275 5,60 ỊUg/ml 678309 4,86jug/ml 778275 5,60 |ug/ml 688509 4,93|ig/ml 759275 5,46 |dg/ml 718314 5,15|ig/ml Kết quả thống kê RSD% = 2,00% x tb = 765496,4 s = 15326,9 sx = 6854 8% = 2,48% Hàm lượng trung bình: 5,504|ig/ml 8% = 4.01% s x = 10155 s - 22708 x tb = 702931.4 RSD% = 3,23% Hàm lượng trung bình: 5,040|ig/ml
*Nhận xét: sắc ký đồ khi định lượng imipenem trong huyết tương người bệnh cân xứng, rõ ràng, tách hoàn toàn ra khỏi các pic khác. Có thể xác định chính xác nồng độ của imipenem tại thời điểm lấy mẫu, từ đó điều chỉnh liều cho phù hợp với từng bệnh nhân, đặc biệt là bệnh nhân lọc máu ngoài thận.
2.3 BÀN LUẬN
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích hiện đại đang được ứng dụng phổ biến trong ngành dược.
Để xây dựng phương pháp định lượng imipenem trong huyết tương bằng HPLC, chúng tôi đã tiến hành khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký và tiến hành thẩm địmh phương pháp đã xây dựng. Phương pháp mà chúng tôi đã khảo sát có các ưu điểm nổi bật như sau:
- Phương pháp có độ đúng cao:Với nồng độ lng/m l có độ tìm lại là 98.1%; Với nồng độ 5|LLg/ml có độ tìm lại là 99.2%; Nồng độ 10 |Lig/ml có độ tìm lại là 94,1%.
- Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng từ 0,l|Lig/m l - 20|Lig/ml, tương quan chặt chẽ r = 0,9997 . Điều đó cho phép định lượng imipenem trên huyết tương bệnh nhân, ở đó từng cá thể có quá trình phân b ố , chuyển hóa và thải trừ khác nhau.
- Chương trình sắc ký đã lựa chọn để phân tích imipenem trong huyết tương đơn giản, hóa chất, dụng cụ thông dụng. Có thể áp dụng tại các bệnh viện được trang bị hệ thống HPLC.
Qúa trình thực nghiệm cho thấy imipenem là chất dễ bị phân hủy do đó, đòi hỏi huyết tương người bệnh phải được bảo quản đúng tiêu chuẩn và thêm các chất bảo quản như MES.
Đối với những bệnh nhân tại khoa điều trị tích cực , thông thường dùng rất nhiều loại thuốc do đó trong quá trình định lượng phải xem xét kỹ bệnh án , tránh sai số khi định lượng imipenem do thuốc khác.
1 Kết luận
Qua thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã thu được một số kết quả như sau:
* Vê mặt nhận thức :
- Biết cách tiến hành nghiên cứu và hoàn thành một đề tài , biết cách tiến hành tra cứu và tìm hiểu tài liệu để tham khảo và phục vụ cho quá trình thực hiện nghiên cứu khoa học.
- Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và biết cách vận hành máy cũng như các thiết bị liên quan.
* v ề kết quả thực nghiệm:
- Xây dựng được quy trình kỹ thuật định lượng imipenem trong huyết tương với các điều kiện cụ thể như sau:
+ Xử lý mẫu: Xây dựng quy trình chiết xuất imipenem từ huyết tương . + Chương trình HPLC định lượng imipenem:
• Cột: Novapak c,g (4,6mm X 150mm), đưòng kính hạt 5|0,m • Detector u v , bước sóng 298nm
• Pha động: Methanol: Acid boric 0,2 M (5 : 95), pH 7,2.điều chỉnh bằng NaOH 0,1M.
• Lưu lượng dòng:0,8 ml/phút • Thể tích tiêm :50 |Lil
• Nhiệt độ phòng.
Với điều kiện sắc ký như trên, pic của imipenem trong huyết tương được tách hoàn toàn ra khỏi các chất khác, pic cân xứng thời gian lưu hợp lý tr=4,208 phút. Phương pháp đã được thẩm định cho thấy độ lặp lại, độ đúng cao. Khoảng tuyến tính rộng, hệ số tương quan giữa diện tích píc và nồng độ chặt chẽ (r = 0,9997). Kỹ thuật tiến hành đơn giản dễ dàng áp dụng cho các cơ sỏ'