glucose huyết do tiêm Adrenalin
Chuột thí nghiệm đã nhịn đói 15 giờ được cho uống dịch chiết lá BLN với liều 18,2 mL/kg (tương ứng với 36,4 g dược liệu khô/kg). Sau 3 giờ, tiêm màng bụng dung dịch Adrenalin liều 0,6 mg/kg. Định lượng glucose huyết vào thời điểm trước khi tiêm và sau khi tiêm Adrenalin 45 phút. Tiến hành tương tự với lô chứng uống nước cất và các lô đối chứng để so sánh là lô chuột được tiêm màng bụng Insulin (0,6 UI/kg), lô uống Metformin (1 g/kg), lô uống Gliclazid (40 mg/kg). Riêng lô dùng Insulin, sau khi tiêm Insulin 1,5 giờ; lô uống Metformin và Gliclazid, sau khi cho chuột uống thuốc 4 giờ, tiến hành tiêm Adrenalin. Sau đó tiến hành tương tự như các lô thử.
c) Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lá cây BLN trên mô hình tăng glucose huyết do Streptozocin (STZ)
72 giờ sau khi tiêm STZ (150 mg/kg), tiến hành định lượng glucose huyết lúc đói của chuột. Lựa chọn chuột có glucose huyết trên 1 lmmol/L cho thí nghiệm. Sau đó, cho chuột uống dịch chiết lá BLN với liều 18,2 mL/kg (tương ứng với 36,4 g dược liệu khô/kg). Định lượng glucose huyết sau 4 giờ. Tiến hành tương tự với lô chứng uống nước cất và các lô đối chứng là lô chuột được tiêm màng bụng Insulin (0,6 UI/kg), lô uống Metformin (1 g/kg), lô uống Gliclazid (40 mg/kg).
2.2.5. Nghiên cứu mối liên quan giữa tác dụng- liều lượng của dịch chiết láBLN BLN
Đổ nghiên cứu sự phụ thuộc giữa tác dụng và liều của dịch chiết lá BLN, chúng tôi tiến hành thí nghiệm song song với 4 lô chuột, mỗi lô được uống dịch chiết ở các liều khác nhau trên mô hình tăng đường huyết thực nghiệm bằng Adrenalin. Quá trình thí nghiệm tương tự như mô tả ở phần 2.2.4 b). So sánh mức tăng glucose huyết cao nhất so với thời điểm 0 giờ giữa các liều của dịch chiết lá cây BLN.
2.2.6. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê với sự trợ giúp của phần mềm Excel 2003. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
2.3. Kết quả
2.3.1. Ảnh hưởng của các dịch chiết lả BLN trên glucose huyết của chuột bình thường
Để đánh giá ảnh hưởng của các dịch chiết lá cây BLN trên glucose huyết của chuột bình thường, chúng tôi xác định mức độ giảm glucose huyết của chuột sau khi uống thuốc với liều 18,2 mL/kg. Kết quả được trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.1.
__ 7 r __ > r
Bảng 2.1. Anh hưởng của dịch chiêt lá Băng lăng nước trên glucose huyêt chuột bình thường
\ , Thời gian
Lô \
Glucose huyết (mmol/L)
Oh lh 2h 3h 4h Nước cất (1) 8,00 ±0,20 7,76 ± 0,24 7,38 ±0,17 6,90 ±0,18 6,46 ±0,13 Ethanol A (2) 8,32 ± 0,67 8,13 ±0,58 p > 0,05* 2,2%** 7,17 ±0,77 p > 0,05* 13,83%** 6,97 ± 0,46 p < 0,05* 16,23%** 5,60 ± 0,64 p < 0,05* 32,67%** Ethanol B (3) 7,86 ± 0,72 5,61 ±0,96 p < 0,05* 28,63%** 5,47 ±0,61 p < 0,05* 30,41%** 4,53 ±0,71 p < 0,001* 42,37%** 3,99 ± 0,28 p < 0,001* 49,24%** Ethanol c (4) 7,86 ±0,19 8,58 ± 0,30 p > 0,05* - 9,21%** 7,73 ± 0,29 p > 0,05* 1,71%** 6,38 ±0,42 p < 0,05* 18,77%** 5,42 ±0,51 p < 0,05* 31,06%** __ r 9 ___ r ọ
10,00 -1 8,00 - s! 6,00 - i 4,00 - 2,00 - 0,00 - Oh lh 2h 3h 4h
—A— 1 Nước cất — 2 Ethanol A —A— 3 Ethanol B 4 Ethanol c
Hình 2.1. Sự biến đổi glucose huyết của chuột bình thường sau khỉ uống dịch chiết BLN
Kết quả cho thấy:
> Với liều thử nghiệm là 18,2 mL/kg, các dịch chiết đều làm hạ
glucose huyết với hàm lượng glucose huyết khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lúc chưa uống dịch chiết BLN, đặc biệt là giờ thứ 3 và giờ thứ 4.
> Dịch chiết Ethanol B thu được bằng phương pháp ngâm lạnh và cất quay dưới áp suất giảm có tác dụng hạ glucose huyết rõ rệt nhất với p < 0,001 ở giờ thứ 3 và giờ thứ 4.
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiấ lá BLN trên một số mô hình tàng glucose huyết thực nghiệm
a) Ảnh hưởng của dịch chiết lá BLN trên mô hình tăng gỉucose huyết ngoại sinh
Mô hình này thể hiện ảnh hưởng của các dịch chiết lá BLN đến khả năng dung nạp glucose của chuột. Sau khi cho chuột uống glucose liều 5 g/kg, sự biến đổi glucose huyết được trình bày ở bảng 2.2 và hình 2.2.
□ % tăng glucose huyết sau khi uống glucose
Hình 2.2. Mức tăng glucose huyết cao nhất sau khỉ uổng glucose
Kết quả trên cho thấy:
> Sau khi cho chuột uống glucose liều 5 g/kg, mức glucose huyết đều tăng lên ở tất cả các lô. Nhưng chỉ ở lô uống dịch chiết Ethanol B và dịch chiết Ethanol c mức tăng glucose huyết kbáe-bĩệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng với p tương ứng là p < 0,01 và p < 0,05.
> So sánh 2 lô uống dịch chiết Ethanol B và dịch chiết Ethanol c với lô
tiêm Insulin không thấy khác nhau có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về mức tăng glucose huyết.
Như vậy trong các lô dịch chiết thử nghiệm, lô uống dịch chiết Ethanol B có tác dụng tốt nhất trên dung nạp glucose của chuột. Do đó, dịch chiết Ethanol B được lựa chọn cho các thí nghiệm kế tiếp.
b) Ảnh hưởng của dịch chiết lá BLN trên mô hình tăng glucose hityết bằng Adrenalin liều 0,6 mg/kg
Ba giờ sau khi uống dịch chiết Ethanol B, chuột được tiêm màng bụng dung dịch Adrenalin liều 0,6 mg/kg. Sự biến đổi glucose huyết của chuột sau khi tiêm được trình bày ở bảng 2.3 và hình 2.3.
Lô nước Lô Insulin Lô Ethanol B Lô Glỉclaáde Lô Metformin □ % tăng glucose huyết cao nhất sau khi tiêm adrenalin
Hình 2.3. Mức tăng glucose huyết cao nhất trên chuột sau khi tiêm Adrenalỉn
Kết quả trên cho thấy, sau khi tiêm Adrenalin, glucose huyết đều tăng ở tất cả các lô chuột thí nghiệm, đặc biệt tăng rất cao ở lô chứng (90,6%) và tăng thấp nhất ở lô Ethanol B (39,42%). So sánh % tăng glucose huyết của lô uống dịch chiết Ethanol B với các lô còn lại, có thể thấy:
> Lô chuột uống dịch chiết Ethanol B có mức tăng glucose huyết thấp hơn rất nhiều và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
> Mức tăng glucose huyết ở lô Ethanol B khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô tiêm Insulin và lô dùng Metformin nhưng lại thấp hơn và khác nhau có ý nghĩa thống kê so với lô Gliclazid.
c) Anh hưởng của dịch chiết lả BLN trên mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm bằng Streptozocin liều 150 mg/kg.
Vào ngày thứ ba sau khi tiêm STZ liều 150 mg/kg, định lượng glucose huyết lúc đói của chuột, sau đó cho chuột uống dịch chiết Ethanol B. Định lượng glucose huyết sau 4 giờ. Tiến hành song song với lô chứng và các lô đối chứng. Kết quả được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.4.
0
Lô nưức cất Lô Insulin Lô Ethanol B Lô diclazide Lô Metformin
□ % hạ glucose huyết
Hình 2.4. Mức hạ glucose huyết (%) trên chuột đã tiêm STZ liều 150mg/kg
Kết quả trên cho thấy:
> Sau 4 giờ, các lô thử đều gây hạ glucose huyết. Mức hạ glucose huyết ở lô uống dịch chiết Ethanol B là 35,91%, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lô chứng uống nước cất và lô uống Gliclazid. > So sánh với lô tiêm Insulin và lô dùng Metíòrmin, mức hạ glucose
huyết của lô Ethanol B khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
2.3.3. Nghiên cứu mối quan hệ liều lượng- tác dụng của dịch chiết lá BLN
Trên mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm bằng Adrenalin, chúng tôi tiến hành song song 4 lô chuột cho uống dịch chiết Ethanol với các liều khác nhau và so sánh mức tăng glucose huyết giữa các lô. Kết quả được thể hiện ở bảng 2.5 và hình 2.5.
___ 9 ■> r ___ > r r
LÔI Lô 2 LÔ3 Lô 4 □ % tăng glucose huyết cao nhất sau khi tiêm Adrenalin
Hình 2.5. Ảnh hưởng của các liều dịch chiết khác nhau đến mức tăng glucose huyết của các lô tiêm Ađrenalin
Kết quả cho thấy, mức tăng glucose huyết của lô 1, lô 2, lô 3 khác nhau không có ý nghĩa thống kê nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) khi so sánh với lô 4 (liều 4,05 mL/kg).
2.4. Bàn luận
2.4.1. về tác dụng hạ gỉucose huyấ của dịch chiết lá BLN
ạ) Trên chuột bình thường và chuột uổnggỉucose ngoại sinh
Các kết quả thí nghiệm cho thấy dịch chiết toàn phần lá BLN với liều 18,2 mL/kg (tương ứng với 36,4 g dược liệu khô/kg) có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột bình thường, đỉnh tác dụng vào giờ thứ 3 và giờ thứ 4 kể tò thời điểm uống thuốc. Đặc biệt tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết Ethanol B là rõ rệt nhất (p < 0,001).
Trên mô hình tăng glucose huyết bởi glucose ngoại sinh, mức tăng glucose huyết ở tất cả các lô uống dịch chiết lá BLN đều khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với lô chứng. Như vậy, dịch chiết toàn phần lá BLN có tác dụng làm tăng dung nạp glucose ở chuột nhắt thí nghiệm. Kết quả này phù họp với một nghiên cứu tiến hành ở trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Theo nghiên cứu này, dịch chiết toàn phần lá BLN có tác dụng ức chế tăng glucose huyết trên chuột cống trắng uống dung dịch glucose [10].
Mặt khác, khi so sánh tác dụng của các dịch chiết khác nhau của lá BLN, kết quả hai thí nghiệm trên còn cho thấy dịch chiết Ethanol B có tác dụng hạ glucose huyết tốt hơn so với dịch chiết Ethanol A và dịch chiết Ethanol c trên cả chuột bình thường và chuột uống glucose ngoại sinh. Thậm chí, mức tăng glucose huyết của lô dùng dịch chiết Ethanol B tương đương với lô tiêm Insulin liều 0,6 Ul/kg (p > 0,05).
Dịch chiết Ethanol B là dịch chiết thu được bằng phương pháp ngâm lạnh và cất quay dưới áp suất giảm để loại dung môi Ethanol, nghĩa là toàn bộ quá trình điều chế dịch chiết này đều sử dụng nhiệt độ không quá 50°c.
Trong khi đó, hai dịch chiết còn lại có sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình chiết xuất (cô cách thủy với dịch chiết Ethanol A và Soxhlet với dịch chiết Ethanol C). Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy rất có khả năng nhiệt độ đã làm phá hủy một số thành phần hoạt chất có tác dụng hạ glucose huyết và do đó làm giảm tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết lá BLN. Với lí do đó, dịch chiết Ethanol B được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này.
b) Trên chuột gầy tăng glucose huyết bằng Adrenalin
Kết quả ở thí nghiệm thứ 3 cho thấy, trong số các lô thử nghiệm, lô dùng dịch chiết Ethanol B có mức tăng glucose huyết thấp nhất. Khi so sánh bằng
phương pháp thống kê, mức tăng glucose huyết của lô uống dịch chiết
Ethanol B thấp hơn rất nhiều so với lô chứng, thấp hơn so với lô dùng Gliclazid, những sự khác biệt này đều có ý nghĩa thống kê. Tác dụng trên
glucose huyết của dịch chiết Ethanol B tương đương với Insulin liều 0,6 Ưl/kg chuột và Metfomin liều 1 g/kg chuột do mức tăng glucose huyết của các lô này khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Như vậy, dịch chiết BLN có tác dụng ức chế tăng glucose huyết ở chuột nhắt trắng tiêm Adrenalin. Kết quả này tương tự với một nghiên cứu tiến hành trên chuột cống trắng, theo đó, dịch chiết bằng aceton của lá BLN cũng có tác dụng hạn chế tăng glucose huyết khi tiêm Adrenalin [10]. Việc tiến hành song song với lô tiêm Insulin cũng góp phần khẳng định mức độ hạ glucose huyết của dịch chiết lá BLN, giống như theo nhận định của Võ Văn Chi, hoạt tính hạ glucose huyết của BLN bằng 6- 7,7 đơn vị Insulin [4].
c) Trên chuột gây tăng đường huyết bởi STZ
Mô hình gây tăng glucose huyết bởi STZ là một mô hình thực nghiệm được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về thuốc điều trị ĐTĐ. Trong nghiên cứu này, liều STZ 150 mg/kg đã gây được mức glucose huyết tăng cao và kéo dài ổn định trong nhiều ngày. Khi cho chuột dùng thuốc, glucose huyết hạ xuống ở tất cả các lô thử. Tương tự như với mô hình tiêm Adrenalin, lô
dùng dịch chiết Ethanol B có mức hạ glucose huyết nhiều hơn lô chứng và lô
Gliclazid, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Trong khi đó, tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết Ethanol B tương đương với tác dụng của Insulin liều 0,6 Ul/kg và Metformin liều 1 g/kg (p > 0,05).
Năm 2000, Viện nghiên cứu Rabiton (Nhật) đã tiến hành nghiên cứu so sánh tác dụng của acid Corosolic (Glucosol TM), một hoạt chất được tách từ lá BLN với các thuốc hạ glucose huyết đường uống khác nhau trên chuột cống tiêm STZ liều 70 mg/kg [31]. Kết quả cũng cho thấy tất cả các lô thí nghiệm đều có sự hạ glucose huyết đáng kể so với lô chứng. Tuy nhiên, tác dụng hạ glucose huyết của Glucosol kém hơn so với Glipizid - một thuốc thuộc nhóm Sulfonylurea có cơ chế tác dụng tương tự Gliclazid mà chúng tôi
sử dụng trong nghiên cứu của mình. Sự khác nhau này có thể bởi liều Glucosol trong nghiên cứu trên còn thấp hoặc trong dịch chiết toàn phần của lá BLN có thể chứa các hoạt chất khác cũng có tác dụng hạ glucose huyết, làm tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết toàn phần mạnh hơn acid Corosolic.
Mặt khác, một nghiên cứu tiến hành ở Viện dược liệu, trên chuột tiêm Alloxan, một chất gây ĐTĐ có cơ chế tương tự STZ cũng cho thấy dịch chiết bằng aceton của lá BLN gây hạ glucose huyết trên chuột thí nghiệm [10].
Như vậy, các kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn thống nhất với một số công trình nghiên cứu đã công bố. Từ đó, có thể khẳng định tác dụng của dịch chiết Ethanol B của lá BLN trên chuột bình thường cũng như trên các mô hình gây tăng glucose huyết thực nghiệm được sử dụng.
2.4.2. về mối liên quan tác dụng- liều lượng của dịch chiết lá BLN
Sau khi đã khẳng định tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết lá BLN, một vấn đề đặt ra là phải lựa chọn một liều dùng thấp nhất có tác dụng hạ glucose huyết tốt. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự phụ thuộc tác dụng- liều lượng của dịch chiết lá BLN với 4 liều khác nhau.
Kết quả cho thấy, với khoảng liều lựa chọn trong thí nghiệm này, không có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng dịch chiết với tác dụng hạ glucose huyết. Khi tăng liều từ 4,05 mL/kg lên 9,1 mL/kg, mức tăng glucose huyết giữa hai lô khác nhau có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng liều lên gấp hai (18,2 mL/kg) và gấp bốn (36,4 mL/kg), mức tăng glucose huyết thay đổi không đáng kể giữa các lô (p > 0,05). Từ đó, chúng tôi đã lựa chọn liều 9,1 mL/kg (tương đương với 18,2 g dược liệu khô/kg) là liều thích hợp cho các nghiên cứu sau này về tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết lá BLN.
2.4.3. về cơ chế hạ glucose huyết của lả BLN
Việc sử dụng các mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm cũng góp phần làm sáng tỏ một phần cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết lá BLN.
Trong mô hình tăng glucose huyết bằng glucose ngoại sinh, mức tăng glucose huyết ở các lô dùng dịch chiết lá BLN đều thấp hơn lô chứng (bảng 2.2). Trong đó, mức tăng glucose huyết ở lô dùng dịch chiết Ethanol B và lô dùng dịch chiết Ethanol c so với lô chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê. Điều này chứng tỏ dịch chiết lá BLN đã làm tăng dung nạp glucose ở chuột thí nghiệm và/hoặc có thể làm giảm hấp thu glucose ở đường tiêu hoá.
Với mô hình tăng glucose huyết bằng Adrenalin, ngoài việc đánh giá tác