Diệt vi khuẩn

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất và dụng cụ

2.5.3. Diệt vi khuẩn

* Chuẩn bị 3 khay thủy tinh

♦ Một khay xi măng phủ bột TN1-3 lên trên, mật độ 0,5261 mg/cm2. ♦ Một khay xi măng không chứa TN1-3.

* Tiến hành khử trùng dụng cụ, cho 20 ml dung dịch nước thải tại hồ Bầu Sen - Đường Nguyễn Thái Học - Thành phố Quy Nhơn vào 3 khay thủy tinh đã chuẩn bị ở trên. Sau đó, cho 3 đĩa này ngoài ánh sáng mặt trời xử lí trong vòng 40 phút.

* Xác định lượng vi khuẩn hiếu khí

♦Hóa chất và dụng cụ

- Môi trường PCA (Plate Count Agar).

- Cồn 700 .

- Pipet 1ml, đĩa petri.

- Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, bể điều nhiệt, tủ cấy vô trùng, nồi hấp.

- Đèn cồn, đèn tử ngoại (UV). - Bút đếm khuẩn lạc.

♦Chuẩn bị dụng cụ

Các dụng cụ thí nghiệm thủy tinh sau khi rửa sạch được đem đi khử trùng bằng cách sấy ở nhiệt độ 160 - 1700C trong 1,5 - 2 giờ. Các dụng cụ để đựng môi trường nuôi cấy vi sinh vật cũng được khử trùng bằng sức nóng khô ở nhiệt độ dưới 1800C.

♦Môi trường nuôi cấy

Môi trường sử dụng là PCA (Plate Count Agar) có pH 7,0 ± 0,2. Môi trường được phân phối vào trong các bình thủy tinh và hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Các bình chứa môi trường chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2 - 80C. Trước khi sử dụng, môi trường phải được đun chảy và làm nguội ở 450C trong bể điều nhiệt.

♦Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí

Nguyên tắc

Tổng số vi khuẩn hiếu khí được đếm bằng cách cấy mẫu và nuôi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C trong 72 giờ.

Quy trình

- Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi mẫu, cấy ít nhất 2 đĩa (tức là thực hiện 2 lần lặp lại). Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường nuôi cấy (PCA) đã được đun chảy và ổn định ở 450C. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đổ môi

trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. - Nuôi ủ: các đĩa được lật ngược và ủ trong 72 giờ ở 300C.

Kết quả

Có thể dùng mắt thường để đếm tất cả số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chỉ chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 để đếm.

Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1 ml mẫu được tính như sau: A (CFU/ml) = N

n

Trong đó:

A là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 ml mẫu.

N là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. n là số đĩa đã chọn (n =3).

* Xác định tổng số Coliforms

Nhóm coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Vì vậy, khảo sát khả năng xử lí coliforms cũng có ý nghĩa hết sức quan trọng.

♦Môi trường và hóa chất

- Môi trường TSA (Tryptone Soya Agar) được chuẩn bị trong các bình hoặc chai thủy tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4-8oC. Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt.

- VRB (Violet Red Bile Agar) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.

♦Quy trình phân tích

Nguyên tắc

Mẫu được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37oC trong 24-48 giờ.

Quy trình

Chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy khoảng 5 ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường. Để ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thương. Bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 45oC lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37oC trong 30 giờ.

Kết quả