3.2.3.1. Nguyên tắc
Thử hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Skehan cùng cộng sự (1990) và Likiwitayawuid cùng cộng sự (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và Trường Đại học Dược, đại học tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Phép thử được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
3.2.3.2. Cách tiến hành
Các dòng tế bào ung thư người được cung cấp bởi ATCC gồm: Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma – tế bào ung thư gan), Lu (Lung cancer – Ung thư phổi).
Các dòng tế bào được nuôi cấy phù hợp: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung thêm L-gluthamin, natri pyruvat, 10% huyết thanh bò và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha logarit sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Thử độ độc tế bào: 200 µM dung dịch tế bào ở pha logarit nồng độ 3x104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường thích hợp cho mỗi dòng tế bào. Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt
đến nồng độ thích hợp. Ủ ở 37oC, 5% CO2, 3 ngày. Giếng điều khiển gồm 200 µM dung dịch tế bào nồng độ 3x104 tế bào/ml ủ trong điều kiện như trên, thêm 50 µM MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37o
C trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µM DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 495-515nm trên máy ELISA.
Chất chuẩn đối chứng có khả năng diệt tế bào: Ellipithin, Vinblastin hoặc Taxol pha trong DMSO.
3.2.3.3. Kết quả
a. Cách tính kết quả
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
( ) ( )
( ) ( )
Giá trị CS % sau khi tính theo công thức trên được đưa vào tính toán excel để tìm ra % trung bình ±độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn
=√∑( )
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp tìm giá trị IC50.
Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 chất III, IV STT Ký hiệu mẫu Nồng độ % tế bào còn sống sót Kết luận Hep-G2 Lu DMSO 100,00±0,0 100,0±0,0 Âm tính Chứng(+) Ellipithin 0,2±0,0 1,2±0,2 Dương tính 1 Chất III 5 μg/ml 87,7±0,9 89,6±0,8 Âm tính 2 Chất IV 20 μg/ml 60,1±0,2 92,3±1,5 Âm tính
Nhận xét: các chất III, IV không có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên cả 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và Lu.