Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp với nồng độ là 100 µg/ml. Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử gồm: mẫu chất I, II, III, IV, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy ở nhiệt độ thấp hơn 60oC đến khô hết dung môi.
Chuẩn bị môi trường và cấy vi sinh vật kiểm định: vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18 - 24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45 - 500C và được cấy giống vi sinh vật kiểm định vào với tỷ lệ 2,5
ml/100 ml. Lắc tròn để vi sinh vật kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa vi sinh vật kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
Ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở to = 37oC trong 18 – 24 giờ, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có (sử dụng thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm).
Đánh giá kết quả: dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
i
D : Đường kính vòng vô khuẩn thứ i
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: số thí nghiệm làm song song (n = 3).