Định lượng RSV trong hỗn dịch liposom trước và sau khi thẩm tích loại RSV tự do theo phương pháp nêu ở mục 2.3.2.2.
Hiệu suất liposom hóa (EE) được tính bằng tỉ lệ % giữa nồng độ RSV trong hỗn dịch liposom sau khi thẩm tích loại RSV tự do với nồng độ RSV trong hỗn dịch liposom trước khi thẩm tích theo công thức (1).
EE% =
(1) Trong đó:
CE là nồng độ RSV tronng hỗn dịch liposom sau khi thẩm tích loại RSV tự do (µg/ml).
Sau khi phá màng và đem đo quang, nếu gọi AE là độ hấp thụ quang của hỗn dịch liposom sau khi thẩm tích và AT là độ hấp thụ quang của hỗn dịch liposom trước khi thẩm tích thì công thức (1) có thể biến đổi thành:
EE% =
Chương III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. Kết quả
3.1.1. Thẩm định phương pháp định lượng RSV
Sau khi quét phổ phát hiện trans - RSV có một cực đại hấp thụ tại bước sóng 308,5 nm trong môi trường Triton 1% và đệm PBS pH 7,4.
Khảo sát ảnh hưởng của tá dược
Tại bước sóng 308,5 nm SPC và chol không hấp thụ quang như vậy hai tá dược này không ảnh hưởng tới phương pháp định lượng.
Khảo sát tính tuyến tính
Chuẩn bị một dãy 6 dung dịch chuẩn có nồng độ chất chuẩn RSV lần lượt là 2, 3, 4, 5, 6, 7 µg/ml từ dung dịch RSV gốc bằng cách hút chính xác lần lượt 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 1,75 ml dung dịch gốc pha loãng bằng hỗn hợp Triton 9/1 vừa đủ 25 ml. Lắc đều đem đo quang ở bước sóng cực đại thu được các giá trị độ hấp thụ AS. Sử dụng chương trình Excel của bộ phần mềm Microsolf Office dựng đường chuẩn thể hiện sự tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ RSV trong dung dịch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị độ hấp thụ quang của các mẫu dung dịch RSV chuẩn ở bước sóng 308,5 nm
Nồng độ RSV
(µg/ml) 2 3 4 5 6 7
Gía trị độ hấp
thụ quang 0,236 0,341 0,452 0,562 0,664 0,775
H nh 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ RSV trong môi trường đệm PBS và Triton 1% ở bước sóng 308,5 nm
Nhận xét: Từ đồ thị ở hình 3.1 ta thấy trong khoảng nồng độ RSV khảo sát (2 - 7 µg/ml), độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ RSV. Đường chuẩn thu được dạng đường thẳng có phương trình hồi quy tuyến tính là y = 0,1078x + 0,0198 với hệ số tương quan R2
= 0,9999 rất gần 1. Như vậy có thể sử dụng phương pháp đo quang ở bước sóng 308,5 nm với khoảng nồng độ trên để định lượng RSV trong liposom.
Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Hút chính xác 5 ml dung dịch RSV gốc pha loãng bằng hỗn hợp Triton 9/1, định mức đủ 150 ml. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch này tại bước sóng cực đại ở 6 thời điểm khác nhau trong ngày (mỗi thời điểm cách nhau khoảng 1 giờ) trên cùng một thiết bị và trong cùng một phòng thí nghiệm. Mỗi giá trị độ hấp thụ quang được đo ba lần lấy giá trị trung bình. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của dãy giá trị thu được, nếu RSD < 2% thì có thể kết luận phương pháp có độ lặp lại cao. Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày ở bảng 3.2. y = 0,1078x + 0,0198 R² = 0,9999 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Đ ộ hấp th ụ qu an g Nồng độ RSV µg/ml
Bảng 3.2. Kết quả đo độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng kỹ thuật đo quang phổ UV – VIS
STT Gía trị độ hấp thụ quang 1 0,375 2 0,372 3 0,376 4 0,377 5 0,380 6 0,381 Atb 0,377 SD 0,003312 RSD% 0,88
Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối của giá trị độ hấp thụ quang là RSD = 0,88% < 2% phép đo có độ lặp lại tốt.
Phương pháp định lượng RSV bằng kỹ thuật đo quang không bị ảnh hưởng bởi tá dược SPC, chol, có độ lặp lại cao và có tính tuyến tính nên có thể áp dụng để định lượng RSV và đánh giá hiệu suất liposom hóa RSV.
3.1.2. Xây dựng quy trình đẩy qua màng
Hỗn dịch liposom trước tiên được đẩy qua màng có kích thước lỗ lọc 400 nm, khảo sát số lần đẩy khác nhau: 7, 9, 11, 13. Lấy mẫu liposom sau các lần đẩy khác nhau đã thẩm tích loại RSV tự do để đánh giá kích thước và phân bố KTTP bằng thiết bị Zetasizer ZS 90.
Kết quả đánh giá kích thước và phân bố KTTP liposom sau khi đẩy qua màng 400 nm được trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Kích thước, phân bố KTTP liposom thu được sau các lần đẩy qua màng 400 nm
Số lần đẩy
PDI Zaverage của
hệ (d.nm) peak KTTP trung bình mỗi peak theo đường kính (d.nm) % theo thể tích Độ rộng peak (dnm) 0 0,535 970,9 1 1000 37,1 269 2 143,86 2,6 31,88 3 5502 60,3 620,8 7 0,256 259,9 1 150,72 7,8 29,12 2 364,8 15,3 164,5 3 4456 76,9 1115,6 9 0,197 251,9 1 95,4 27,5 26,78 2 373,6 72,5 165,64 3 0 0 0 11 0,197 246,9 1 134,02 32,6 35,8 2 414,2 67,4 180,18 3 0 0 0 13 0,140 224,4 1 248 100 102,28 2 0 0 0 3 0 0 0
H nh 3.2. Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 400 nm
Nhận xét: Hỗn dịch liposom trước khi đẩy qua màng có kích thước lớn và phân bố kích thước tiểu phân rộng (PDI lớn). Sau khi đẩy qua màng 400 nm kích thước trung bình và chỉ số PDI của hệ giảm dần theo số lần đẩy chứng tỏ hệ trở nên đồng nhất hơn. Sau 7 lần đẩy PDI giảm mạnh nhất, giảm tới 50% (từ 0,535 xuống còn 0,256). Các lần đẩy tiếp theo PDI giảm trung bình 20 – 30%. Số lượng peak và tỷ lệ phần trăm theo thể tích của các tiểu phân kích thước lớn hàng nghìn nm giảm và tỷ lệ phần trăm theo thể tích của các tiểu phân kích thước nhỏ tăng lên qua các lần đẩy và đến lần đẩy thứ 13 thu được hệ đơn phân tán với 1 peak.
Mục tiêu quá trình đẩy qua màng 400 nm là giảm tỷ lệ tiểu phân kích thước lớn và tăng tỷ lệ tiểu phân kích thước nhỏ làm cho hệ có kích thước nhỏ hơn và phân bố KTTP đồng nhất hơn tránh hiện tượng nứt vỡ liposom khi đẩy qua màng kích thước lỗ lọc nhỏ (80 nm). Từ bảng 3.3 và hình 3.2 ta thấy sau 13 lần đẩy qua màng 400nm thu được hệ đơn phân tán với chỉ số PDI nhỏ (0,14) nên lựa chọn số lần đẩy là 13 lần cho giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu liposom sau khi đẩy 13 lần qua màng có kích thước lỗ lọc 400 nm được đẩy tiếp qua màng 80 nm, khảo sát số lần đẩy khác nhau: 5, 7, 9, 11, 13, 15 lần. Lấy mẫu ở số lần đẩy khác nhau đem thẩm tích loại RSV tự do, sau đó
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 7 9 11 13 P DI Số lần đẩy
đánh giá ảnh hưởng của số lần đẩy tới kích thước, phân bố KTTP và hiệu suất liposom hóa. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kích thước, phân bố KTTP và hiệu suất liposom hóa của liposom thu được sau khi đẩy qua màng 80 nm
Số lần đẩy PDI Zaverage của hệ (d.nm) Peak KTTP trung bình mỗi peak theo đường kính % theo thể tích Độ rộng peak (d.nm) Hiệu suất (%) 5 0,111 127 1 112,4 100 44,63 95,1 7 0,096 117,9 1 106,5 100 33,58 94,8 9 0,080 113,2 1 102,06 100 30,64 95,18 11 0,062 112,9 1 101,5 100 30,1 95,04 13 0,054 110,8 1 100,94 100 27,78 94,93 15 0,043 109,9 1 100,46 100 26,82 95,06
PDI của hệ thu được sau các lần đẩy qua màng 80 nm nhỏ, hệ đơn phân tán với 1 peak và độ rộng peak hẹp. Sự thay đổi kích thước trung bình và chỉ số PDI của hệ theo số lần đẩy được thể hiện rõ hơn ở hình 3.3 và hình 3.4.
H nh 3.3. Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80 nm
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 5 7 9 11 13 15 PD I Số lần đẩy
H nh 3.4. Đồ thị kích thước trung b nh của hệ qua các lần đẩy qua màng 80 nm
Nhận xét: Qua các lần đẩy qua màng 80 nm PDI của hệ giảm dần về không chứng tỏ hệ càng trở nên đồng nhất hơn. Kích thước trung bình của hệ giảm theo số lần đẩy. Từ sau lần đẩy thứ 9 kích thước trung bình của hệ giảm không đáng kể, PDI giảm dần ổn định sau 15 lần đẩy.
Từ bảng 3.4 ta thấy hiệu suất liposom hóa của các mẫu liposom RSV thu được ở số lần đẩy khác nhau khá cao ≈ 95% và có thể thấy số lần đẩy qua màng dường như không ảnh hưởng tới hiệu suất liposom hóa.
Qua khảo sát có thể chọn số lần đẩy qua màng 80 nm là 15 lần cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện siêu âm tới các đặc tính của liposom liposom
Lấy các mẫu liposom sau các khoảng thời gian siêu âm khác nhau với tần số siêu âm liên tục hay gián đoạn (nhịp phát xung 0,6 s), thẩm tích loại RSV tự do. Tiến hành đánh giá kích thước, phân bố KTTP, hiệu suất liposom hóa theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.2.
100 105 110 115 120 125 130 5 7 9 11 13 15 Z av erag e (d .nm ) Số lần đẩy
- Kết quả đánh giá về kích thước và phân bố KTTP được trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện siêu âm tới kích thước, phân bố KTTP
Điều kiện PDI
Zaverage của hệ (d.nm) peak KTTP trung bình mỗi peak theo đường kính % theo thể tích Độ rộng peak (d.nm)
Chưa siêu âm 0,535 970,9
1 1000 37,1 269
2 143,86 2,6 31,88
3 5502 60,3 620,8
Siêu âm liên tục 3
phút 0,31 183,4
1 82,22 60,7 42,7
2 524,6 19,1 264,4
3 5046 20,2 829,4
Siêu âm liên tục 5
phút 0,302 158,6
1 70,08 87,2 40,38
2 385,6 12,8 144,1
3 0 0 0
Siêu âm gián đoạn nhịp phát xung 0,6s 3 phút 0,492 257,4 1 159,5 16,3 60,38 2 1375,6 30,6 449,4 3 5294 53,1 708
Siêu âm gián đoạn nhịp phát xung 0,6s 5 phút 0,447 219,6 1 35,3 5,9 5,97 2 132,06 28,2 94,9 3 2968 65,8 1549
Siêu âm gián đoạn nhịp phát xung 0,6s 7 phút 0,422 212,8 1 193,96 13,8 125,16 2 3482 63,6 1247 3 40,56 22,6 10,30
Siêu âm gián đoạn nhịp phát xung 0,6s 10 phút 0,396 193,82 1 84,56 32,4 41,84 2 439,4 9,2 187,98 3 4892 58,4 904
Nhận xét:
- Mẫu chưa siêu âm có kích thước và chỉ số đa phân tán lớn hơn mẫu sau siêu âm. Siêu âm làm giảm kích thước và PDI của hệ.
- Thời gian siêu âm càng dài kích thước trung bình và PDI càng giảm (từ 0,535 trước khi siêu âm xuống 0,302 khi siêu âm liên tục 5 phút), hệ trở nên đồng nhất hơn (ít peak hơn và/ hoặc peak gọn hơn).
- Với cùng thời gian siêu âm thì siêu âm liên tục tạo ra hệ liposom có kích thước và PDI nhỏ hơn tức là đồng nhất hơn so với siêu âm ngắt quãng.
Kết quả đánh giá hiệu suất liposom hóa RSV của các mẫu siêu âm ở điều kiện khác nhau được trình bày ở bảng 3.6:
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của điều kiện siêu âm tới hiệu suất liposom hóa RSV
Điều kiện siêu âm
Nhịp phát xung
Liên tục Gián đoạn (nhịp phát xung 0,6 s) 3 phút 5 phút 3 phút 5 phút 7 phút 10 phút Hiệu suất
% 92,2 90,03 95,1 94,8 93,79 92,9
Nhận xét: Thời gian siêu âm càng dài hiệu suất liposom hóa càng giảm. Với cùng thời gian siêu âm thì siêu âm liên tục có hiệu suất liposom hóa thấp hơn siêu âm gián đoạn.
Từ bảng 3.5 và bảng 3.6 ta thấy khi siêu âm liên tục kích thước và PDI giảm nhiều hơn siêu âm gián đoạn tuy nhiên hiệu suất liposom hóa lại thấp hơn. Với siêu âm gián đoạn mặc dù hệ liposom sau siêu âm 10 phút có PDI giảm nhiều nhất (0,396 so với 0,535 trước khi siêu âm) tuy nhiên hiệu suất liposom hóa lại thấp nhất. Để đảm bảo hiệu suất liposom chọn điều kiện siêu âm gián đoạn nhịp phát xung 0,6 s trong thời gian 5 phút.
3.1.4. So sánh hai phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân: siêu âm và đẩy qua màng đẩy qua màng
Liposom được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo theo quy trình ở mục 2.3.1.1 và được làm nhỏ kích thước tiểu phân theo một trong hai phương pháp siêu âm đầu dò (thời gian 5 phút, nhịp phát xung 0,6 s) hoặc đẩy qua màng (đẩy lần lượt 13 lần qua màng 400 nm và 15 lần qua màng 80 nm). Đánh giá liposom tạo thành về kích thước, phân bố KTTP, hiệu suất liposom hóa và sơ bộ hình thái liposom. Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.5.
Bảng 3.7. Kích thước, phân bố KTTP, hiệu suất liposom hóa của liposom được làm nhỏ KTTP bằng siêu âm và đẩy qua màng
Phương pháp
Kích thước tiểu phân trung bình theo đường kính
Chỉ số đa phân
tán (PDI) Hiệu suất %
Siêu âm 219,6 0,447 94,80
Đẩy qua màng 109,9 0,043 95,06
Nhận xét: Hệ liposom tạo thành theo hai phương pháp siêu âm và đẩy qua màng có hiệu suất gần tương tự nhau. Tuy nhiên phương pháp đẩy qua màng cho tiểu phân liposom kích thước nhỏ hơn 1/2 lần và chỉ số PDI nhỏ hơn rất nhiều lần, tức là hệ đồng nhất hơn so với phương pháp siêu âm.
Đánh giá hình thái liposom tạo thành bằng thiết bị TEM với kỹ thuật nhuộm soi âm bản. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.5.
A B
H nh 3.5. H nh ảnh chụp TEM của mẫu liposom làm nhỏ kích thước bằng phương pháp siêu âm (A) và đẩy qua màng (B)
Nhận xét: Cả hai phương pháp đều tạo được liposom có dạng gần cầu. Phương pháp đẩy qua màng cho liposom có kích thước phân bố khá đồng đều kích thước khoảng từ 111 – 130 nm. Phương pháp siêu âm tạo liposom kích thước phân tán hơn, quan sát thấy có hiện tượng nứt vỡ liposom.
3.2. Bàn luận
Về phương pháp định lượng RSV và đánh giá hiệu suất liposom hóa:
Nghiên cứu lựa chọn phương pháp đo quang phổ hấp thụ để định lượng RSV, phương pháp này có ưu điểm là dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện thiết bị thực nghiệm. Sau một số phép thẩm định thấy rằng các tá dược SPC, chol không hấp thụ quang tại bước sóng định lượng 308,5 nm do đó không ảnh hưởng tới phép đo. Mặt khác phương pháp này có tính tuyến tính và độ lặp lại cao. Vì vậy có thể ứng dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ để định lượng RSV trong liposom và đánh giá hiệu suất liposom hóa. Một điểm cần lưu ý ở đây là trans - RSV dạng tự do trong dung dịch rất nhạy cảm với ánh sáng do đó trong quá trình phá màng phải có biện pháp tránh ánh sáng (bọc giấy bạc), thao tác đo nhanh chóng để tránh hiện tượng chuyển dạng đồng phân trans - RSV sang dạng cis làm ảnh hưởng tới kết quả phép đo.
Về phương pháp làm nhỏ và đồng nhất hóa kích thước tiểu phân:
Nghiên cứu này sử dụng hai phương pháp thường dùng nhất hiện nay là siêu âm và đẩy qua màng. Trong phương pháp siêu âm đầu dò các tiểu phân ở càng gần que siêu âm càng chịu tác động lực siêu âm với cường độ lớn hơn, do đó các tiểu phân được làm nhỏ với mức độ khác nhau. Vì vậy hệ liposom thu được có khoảng phân bố kích thước rộng (bảng 3.5). Siêu âm đầu dò đưa một năng lượng lớn vào mẫu, lực phân cắt lớn có thể làm nứt vỡ liposom và làm tăng nhiệt độ mẫu siêu âm đặc biệt là khi siêu âm liên tục. Nếu không kiểm soát tốt nhiệt độ có thể tăng trên nhiệt độ chuyển pha của SPC. Hậu quả là lớp màng lipid kép ở trạng thái tinh thể lỏng khả năng lưu giữ RSV kém đi và RSV có thể bị lực siêu âm đẩy ra khỏi màng làm giảm hiệu suất liposom hóa. Điều này có thể giải thích cho hiện tượng giảm hiệu suất liposom hóa