Acyl hóa amin bằng acid carboxyclic

4. TỔNG HỢP HÓA HỌC

4.3. Acyl hóa amin bằng acid carboxyclic

Acid carbonxylic là tác nhân acyl hóa yếu, muốn thực hiện phản ứng cần có xúc tác có khả năng hoạt hóa mạnh. Các xúc tác hay dùng là CDI N,N-carbonyldimidazol, isobutylcloroformat, N-hydroxysuccinimid, HBTU (2-(lH-Benzotriazolẽl-yl)-l,l,33-

tetramethyluronium hexafluorophosphate, các carbodimid như DCC,

(dicyclohexylcarbodiimide), EDC (ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide)... R. + COa +

Ị

>

22

Phần II: NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯOXG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIÉT BỊ 2.1.1. Hóa chất

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Bao gồm:

- Hydroxylamin hydroclorid - Anhydrid succinic - Methyl 3-aminopropanoat - CDI (1, r -carbonyldiimidazol) - Các dẫn chất của anilin gồm: Anilin 4-methoxyanilin 4-cloroanilin 4- cyanoanilin

- Các hóa chất và dung môi khác cần cho tổng hợp: NaOH, DCM (dicloromethan),

DMF (N,N-dimethylformamid), MeOH (methanol), HCl, aceton.

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), chị thị màu vạn năng.

- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.

- Nhiệt độ nóng chảy (t°nc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer - USA tại bộ môn Hóa vật liệu - Khoa hóa - Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nộị

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của Viện hóa học Việt Nam và Khoa hóa - Trường đại học KHTNHN.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*H - NMR) và carbon ('^c - NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u

- Tổng hợp N'-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N'^-phenylsuccinamid và dẫn chất. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.

Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng tế bào ung thư.

- Đánh giá liên quan cấu trúc-tác dụng theo sự thay đổi các nhóm thế và kết quả thử hoạt tính của các hợp chất tổng hợp được.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

- Tổng họp N^-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N"‘-phenylsuccinamid và 3 dẫn chất. - Kiểm tra độ tinh khiết.

- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.

- Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng ung thư in vitro của 4 chất tổng hợp được. - Đánh giá liên quan cấu trúc-tác dụng giữa các dẫn chất không có nhóm thế, có

nhóm thế hút điện tử, đẩy điện tử thông qua IC50 và kết quả thử độc tính tế bàọ

2.3.1. Tổng hợp hóa học

- Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất thiết kế.

- Khảo sát và tiêu chuẩn hóa điều kiện phản ứng để thu được hiệu suất tối ưụ - Kiểm tra nhanh phản ứng bằng TLC

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy

2.3.2. Xác định cấu trúc

Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: Phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (^H - NMR), Phổ cộng hưởng từ carbon ('^C-NMR).

* Phổ hồng ngoại (IR): Phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa hóa, Trường đại học

24

6 0 0 c m 'Mầu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [2, 5, 6].

* Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng các chất He3-He4 được ghi tại Khoa hóa Trường đại học KHTN Hà Nội với chế độ đo EI, dung môi aceton. Phổ khối lượng của dãy Hal-Ha4 và Hel, He2 được ghi tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên -

Viện khoa học công nghệ Việt Nam với chế độ đo ESI, dung môi aceton.

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*H - NMR) và phổ cộng hưởng từ carbon -

NMR) của dãy chất Hal-Ha4 được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam dùng dung môi DMSO, lấy mổc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).

2.3.3. Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư

Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong rVSMCs. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so với mẫu trắng, chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bổ trước đây [4, 25].

2.3.3.Ị Phân lập histon và Western Blot

- Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào: tế bào ung thư trục tràng SW620 được phân

tán trong môi trường nuôi cấy DMEM gồm 2mM glutamine, 10% huyết thanh bào thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt cùng với 50U/ml penicillin và 50|ag/ml streptomicin. Dịch này được chia vào 96 lỗ của đĩa thử và điều chỉnh đến nồng độ tế bào/lỗ.

Tất cả tế bào được ủ trong 24h ở 37°c với không khí có chứa 5% (w/v) CO2 trước khi

thêm dung dịch của Hal-Ha4/DMS0. Các chất Hal-Ha4 được hòa tan trong DMSO tạo dung dịch gốc có nồng độ lOmM, bảo quản ở -80°c. Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường DMEM không có huyết thanh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ trong khoảng từ 0,1-100|^M. Nồng độ DMSO cuối cùng không vượt quá 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng

độ DMSO đúng bằng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử. Sau khi thêm dung dịch các Ha, tiếp tục ủ thêm 1 ngày, sau đó dùng các đĩa thử này để thực hiện các thử nghiệm tiếp theọ

- Phân lập histon và Western blot: các histon được phân lập bằng phương pháp

chiết acid. Chuẩn bị các đĩa thử có chứa mẫu thử và tế bào phân tán trong môi trường nuôi cấy (như trên), song song làm mẫu trắng (không có mẫu thử) và mẫu đối chiếu (chỉ có dung dịch chứa DMSO). Sau đó các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphatẹ rVSMCs được dung giải trong dung dịch dung giải đệm làm lạnh bằng nước đá [lOmM HEPES (PH 7,9); 1,5 lĩiM KCl, 0,5 mM DTT

và 1,5 mM phenylmethylsulfonylfluoride], sau đó 5M H2SO4 được thêm vàọ Sau khi ủ

trong đá 1 giờ, hỗn dịch được ly tâm và phần còn lại được thu hồi, trộn với acetone với tỷ lệ 9:1 sau đó giữ ở

-20^c

Ị3.3.2. Thử độc tính tế bào in vitro:

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vỉtro được thực hiện tại Khoa Dược, Trưòfng Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT. Dòng tế bào thử nghiệm là tế bào ung thư đại tràng SW620.

MTT ((3-(4.5-dimethylthiazol-2-vl)-2.5-diphenvltetrazolium bromide) là 1 thuốc nhuộm tan trong nước, khi được hòa tan trong tế bào sống có sẽ tạo thành formazan có màu tím và không tan trong nước. Như vậy dựa vào phép đo màu MTT có thể xác định được số lượng tể bào sống trong phép thử độc tính tế bàọ

26

Các đĩa tế bào sau khi ủ 1 ngày với các dẫn chất Ha được nhuộm trong 3 giờ với dung dịch MTT/đệm phosphat đẳng trương (nồng độ 5mg/ml). Sau đó rửa sạch MTT còn lại bằng nước (không rửa với đệm phosphat đẳng trương), Phần thuốc nhuộm đã liên kết với tế bào sóng được chiết bằng isopropanol acid hóa hoặc DMSO rồi được đem đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 550 nm. Kết quả cuối cùng được tính theo kết quả trung bình của 4 lần thử độc lập với nhaụ

Giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probit. Theo phép thử này, nếu kết quả IC50< 30|ig/ml thì được coi là có hoạt tính.

2.3.4. Đánh giá mổí ỉiên quan cấu trúc - tác dụng

Dựa vào kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC, giá trị IC50 thu được có thể xác định

sơ bộ mối tương quan giữa hoạt tính và các nhóm chức thế khác nhau, so sánh hoạt tính giữa họp chất không có nhóm thế, có nhóm thế hút điện tử và có nhóm thế đẩy điện tử.

P H Ầ N 3: T H Ụ C N G ĨỆ M - K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

3.1. HÓA HỌC

3.1.1. TỐNG HỢP HÓA HỌC

3.1.1.1. Tổng họp acid 4-oxo-4-(phenylammo)butanoic và dẫn chất (dãy H1-H4) > Quy trình chung:

Quá trình tổng hợp các dẫn chất H1-H4 được tiến hành theo khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học khóa 2005-2010 của dược sỹ Phan Nữ Nguyệt Thịnh [4]:

,o ^NHCOCHaCHaCOOH ,NHj P o D M F pyridin

Sơ đồ 1: Tổng hợp các dẫn chất của acid 4-phenylamino-4-oxobutanoic

Trong đó:

Chât R Chât R

HI H- H3 CH3O-

H2 Cl- H4 CN-

Tiến hành chung:

Thực hiện phản ứng: Bình cầu, con khuấy rửa sạch, sấy khô ở

60°c

1 lượng khoảng 5mmol (500mg) anhydrid succinic, 5mmol dẫn chất của anilin, đong 4ml DMF và 0,5ml pyíidin cho vào bình cầu 50 ml có nút màị Đặt bình cầu lên máy khuấy từ (số vòng quay 300 vòng/phút). Gia nhiệt và duy trì nhiệt độ phản ứn ở 50°c trong vòng 24-48h. Sau 24h kiểm tra phản ứng bằng TCL với hệ dung môi n-hexan : aceton = 4:3. Dung dịch chấm sắc kí bao gồm dẫn xuất anilin/aceton; anhydrid succinic/DMF; hỗn hợp sau phản ứng/aceton. Hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.

Xử lý hỗn hợp sau phản ứng;

28

+ Để yên 30ph cho tủa hết. Lọc, rửa tủa bằng nước cất đến khi sạch hết pyridin và nguyên liệu (kiểm tra lại bằng TLC).

+ Sấy tủa ở

60°c,

Dưới đây là quy trình cụ thể tổng hợp 4 chất H1-H4:

3.1.1.1.1. Tổng hợp acid 4-oxo-4-(phenylamino)butanoic (Hl) Sơ đồ phản ứng: ,o , N H C 0 C H 2 C H 2 C 0 0 H P pyridin

- Quy trình tiến hành giống như quy trình chung tổng hợp dãy chất H1-H4 với nguyên liệu ban đầu là anilin và anhydrid succinic.

Kết quả:

+ Thể chất rắn, màu vàng nhạt. + Hiệu suất: 62,4 %.

+ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM, aceton. ít tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.

+ Kiểm tra sắc ký lóp mỏng với pha động là n-hexan : aceton = 4:3 và soi dưới đèn tử

ngoại ta thu được một vết rõ với Rf =0.35.

3.1.1.1.2. Tổng hợp acid 4-(4-clorophenylamino)-4-oxobutanoic (H2) Sơ đồ phản ứng: p ,N H C 0 C H 2 C H 2 C 0 0 H DMF pyridin Cl'

- Quy trình tiến hành giống như quy trình chung tổng hợp dãy chất H1-H4. Dần chất alinin ở đây là 4-cloroanilin.

- Kết quả:

+ Thể chất rắn, màu trắng. + Hiệu suất: 96,92%.

+ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM, aceton. ít tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.

+ Kiểm tra sắc ký lớp mỏng với pha động là n-Hexan : Aceton = 4:3 và soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf =0.35.

3.1.1.1.3. Tổng hợp acid 4-(4-methoxyphenylamino)-4-oxobutanoic (H3) Sơ đồ phản ứng: DMF ^^^^NHCOCHsCHsCOOH pyriđin H3C0

- Quy trình tiến hành giông như quy trình chung tổng hợp dãy chất H1-H4. Dan chất

alinin ở đây là 4-methoxyanilin. Kết quả:

+ Thể chất rắn, màu tím đậm. + Hiệu suất: 78,8%.

+ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM, aceton. ít tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.

+ Kiểm tra sắc ký lớp mỏng với pha động là n-Hexan : Aceton = 4:3 và soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf = 0.32

3.1.1.1.4. Tổng hợp acid 4-(4-cyanophenylamino)-4-oxobutanoic

30

DMF pyridin

^^^.^^NHCOCHzCHzCOOH

NC

Quy trình tiến hành giông như quy trình chung tổng hợp dãy chất H1-H4. Dần chất

alinin ở đây là 4-cyanoanilin. Kết quả;

+ Thể chất rắn, màu trắng. + Hiệu suất: 78,3%-

+ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM, aceton. ít tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.

+ Kiểm ữa sắc ký lớp mỏng với pha động n-hexan : aceton = 4:3 và soi dưới

đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf =0.31.

Bảng 2: Tổng hợp tính chất lý hóa, Rfvà hiệu suất của dãy chất H1-H4

H CTCT _{CTPT - KLPT} ^{Thể chất,} màu Dung môi kết tinh lai Rf Hiệu suất (%) HI l; /N H C O C H2CH2COOH CioHuNOs 193 Bột kết tinh màu vàng nhạt Nước 0,35 62,4 H2 Cl /N H C O C H2CH2COOH C10H10CINO3 227,5 Bột kết tinh màu trắng Nước 0,35 96,92 H3 H3C0 N H C O C H2C H2C O O H C„Hi3N04 223 Bột kết tinh màu tím đậm Nước 0,32 78,8 H4 NC^ N H C O C H2C H2C O O H C11H10N2O3 218 Bột kết tinh màu trắng Nước _0,31 78,37

3.1.1.2. Tổng họp methyl 3-(4-oxo-4-(phenylamino)butanamido)propanoat và dẫn chất (dãy Hel-He4)

> Quy trình chung:

Quy trình tổng họp dãy chất He được thực hiện theo V.Adrianov và cộng sự [26];

TEA OCH, CDI ^ 0 0 ^ J 0 ^ + H20 13 R'

Sơ đồ 2: Tổng hợp methyl 3-(4-oxo-4-(phenylamino)butanamido)propanoat và dẫn chất Trong đó: Chât R Chât R Hel H- He3 CH3O- He2 Cl- He4 CN- Cách tiến hành chung;

- Cân 1 lượng acid vào 1 lọ thủy tinh khô sạch, hòa tan bằng 2 ml DMF, hoạt hóa bằng CDI (tỷ lệ acid ; CDI = 1:1), hoạt hóa lOphút (để yên đến khi hết sủi bọt). Làm lạnh bằng nước đá.

- Ester cho vào bình cầu 50ml, hòa tan bằng Iml DMF, thêm TEA (tỷ lệ ester : TEA= 1:2, tỷ lệ acid : ester=l,5:2). Làm lạnh bằng nước đá.

- Đổ từ từ dịch trong lọ thủy tinh vào bình cầu, khuấy đều ở nhiệt độ phòng khoảng

30phút sau đó tăng nhiệt độ đến 50-60°C. Theo dõi phản ứng trong 24h.

- Kiểm tra TLC trong quá trình phản ứng. Hệ dung môi DCM; MeOH; acid acetic = 9 : 1 : 0,5. Soi dưới đèn tử ngoại thấy vết ester ở trên vết nguyên liệu acid, gần đỉnh dung môị

Xử lý hỗn hợp:

32

- Lọc lấy tủa, nếu kiểm tra TLC thấy có lẫn vết acid ban đầu thì rửa tủa với 1 lượng nhỏ Na2CƠ3 5% sau đó rửa lại bằng nước cất.

Sấy khô tủa ở

60°c

Dưới đây là quy trình cụ thể tổng hợp 4 chất Hel-He4:

3.1.1.2.1. Tổng hợp methyl 3-(4-oxo-4-(phenylammo)butanamido]propanoat (Hel) - Sơ đồ phản ứng: COOH

o

o

Kết quả:

+ Thể chất: bột kết tinh, màu trắng. + Hiệu suất: 40,5%.

+ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM, aceton, ít tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.

+ Kiểm tra sắc ký lớp mỏng với pha động là DCM; MeOH: acid acetic = 9 : 1: 0,5 và soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rổ với Rf = 0,7.

3.1.1.2.2. Tổng hợp oxobutanamido)propanoat (He2) - Sơ đồ phản ứng: methyl 3-(4-(4-clorophenylamino)-4- COOH cr

o

ọ

- Tiến hành phản ứng và xử lý hỗn hợp sau phản ứng theo quy trình chung tổng hợp dãy Hel-He4, acid sử dụng là acid 4-(4-clorophenylamino)-4-oxobutanoic (H2). - Kết quả:

+ Thể chất: bột kết tinh, màu trắng. + Hiệu suất: 47,2%.

+ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM, aceton, ít tan trong MeOH. Không