3. CÁCCHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASẸ
3.3.2. Liên quan giữa cấu trúc-tác dụng
3.3.2.1. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt
Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt nhằm khai thác sự khác biệt ở phần miệng kênh enzym giữa các HDAC, từ đó có thể thiết kế công thức làm tăng hoạt tửứi hoặc tăng khả năng ức chế chọn lọc. Nhóm nhận diện bề mặt chủ yếu là các vòng, có thể là vòng thơm hoặc peptid vòng. Các nghiên cứu cho thấy nhóm nhận diện bề mặt là vòng thơm
TRƯỜNG ĐH Dì ^ ộ ỉ
.-V»« f« !?! r. ’•» s-V pv t-
r H ií 0 ic:
18
thì tác dụng tốt hơn vòng nọ Mặt khác vòng lớn thường tốt hơn vòng nhỏ. Ví dụ khi thay nhóm phenyl của SAHA bằng vòng indol thì IC50 của dẫn chất indol nhỏ hơn SAHA nhiều lần (ví dụ 12a, 12b).
9 0 .OH H H Ar HDAC NE HT10B0 IHDA435 ICsB (nM) ÍO50 im 2 SAHA 143 2,4 1J 2» Ph (reverse SAHA) 1006 12íi H 0\ìẹ 0,14 0.15 121) H 0.12 0.13
Việc thay đổi (C) còn ảnh hưởng đến khả năng ức chế chọn lọc của các HDACi, nhóm nhận diện bề mặt nhỏ thường tạo ra các HDACi không chọn lọc, còn các vòng lớn như peptid vòng thì làm tăng khả năng ức chế chọn lọc: SAHA và các acid hydorxamic có nhóm (C) nhỏ ức chế không chọn lọc HDAC I và II, trong khi CHAP (các hydroxamic tổng hợp chứa peptid vòng) chỉ ức chế chọn lọc một số HDAC nhóm Ị Điều này có thể do HDAC nhóm II có phần vành trên bề mặt miệng túi enzym được tạo thành từ 2 vòng xoắn có thể ngăn cản liên kết với phần peptid vòng của HDACị Cấu trúc càng cồng kềnh thì càng khó tương thích với các HDAC khác nhau mặc dù
chúng vẫn thế hiện tác dụng ức chế mạnh HDAC (CHAP có IC50 tương ứng vơi HDAC
1 và 6: 0,38 -13nM). Tuy nhiên nhóm nhận diện bề mặt quá lớn cũng làm giảm tác dụng do làm cho HDACi khó thâm nhập vào vị trí xúc tác của HDAC. Nếu là vòng thơm nhỏ, muốn thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc thì phải tăng số lượng vòng thơm trong nhóm nhận diện bề mặt, tạo liên kết amid giữa các vòng thơm với nhau sẽ làm tăng khả năng ức chế chọn lọc. Hợp chất (13) ức chế HDAC 1,2,3 từ 10-250 lần mạnh
hơn HDAC6,8 (H D A Cl ICC50 là 36 nM). Khi vòng thơm có mặt các halogen cũng có
3.3.2.2. Thay đổi phàn cầu nối MẻN' o __ 0 B 14íi 4X CHj 14b 5 X CHỈ 14c 6 X CHỈ 14d 7kCH2 HDAC1 íCso (nM) 1500 500 65 135
Spacer R Maize HD2 HDAC NE HCT116
IC50 (nM) ICsoinM) ICsadiM) 15 a SxCHj H NA at 40 fiM 15b 4xCH2 H 2000 >10000 15 c SxCHj H 100 244 15 d BxCHa H 100 46 0.21 15e 7X CHa H 300 145 0.5 15f 5xCH2 Me ND 443
TSA và SAHA là 2 điển hình cho phần cầu nối có 5- 6 nguyên c, chúng thể hiện
tác dụng ức chế mạnh HDAC (IC50 tương ứng là 5nM, 65nM). Hầu hết các nghiên cứu
đều chỉ ra rằng khoảng cách tốt nhất giữa nhóm hydroxamic acid và phần (C) là 5, 6, 7
nguyên tử c, với khả năng ức chế theo thứ tự số nguyên tử c 6 > 5~ 7 » 4, 3. Trong phần cầu nối, liên kết amid có vai trò khá quan trọng, ở dãy (15), nếu R là nhóm methyl (15f) thì tác dụng giảm đi đáng kể. Tuy nhiên liên kết amid này cũng không phải quá cần thiết như trong trường hợp của TSA và các chất 14a-d. Phần cầu nối chứa vòng thơm có thể ảnh hưởng đến tác dụng ức chế chọn lọc HDAC, cũng như đến hiệu
lực của HDACị Nếu cầu nối là mạch c béo mà thiếu nhóm nhận diện bề mặt như các
acid béo mạch ngắn thì hầu như khó tương thích với túi enzym của HDAC nhóm Ilb. Việc đảo chiều liên kết amid cũng làm thay đổi tác dụng của HDACi: IC50 giảm rõ rệt khi đổi chiều liên kết amid ở SAHA: IC50 tương ứng khi thử tác dụng ức chế HDAC chiết từ nhân tế bào; 143 (SAHA)/1006nM [23],
3.3.2.S. Thay đổi nhóm chức tạo chelat với kẽm
Khả năng tạo phức với ion tại trung tâm hoạt động của HDAC quyết định tính
đặc hiệu và hiệu lực của các HDACị Hiện nay 1 số nhóm có thể liên kết với bao
gồm acid hydroxamic, sulfanamid, nhóm chức aminoanilin, thiol, acid
carboxylic...Nhóm acid hydroxamic tạo chelat bền vững với nhất và vẫn là 1
20
hydroxamic đều ức chế HD AC ở nồng độ nanomol. Các hợp chất còn lại đa phần ức
chế HD AC với IC50 ở mức nM. Mặt khác việc thay đổi nhóm A cũng làm thay đổi tính
chọn lọc của HDACi: các hợp chất benzamid (BZG là o-aminoanilin) chủ yếu ức chế
chọn lọc HDAC nhóm I, còn sulfamid lại chủ yếu ức chế HDAC6 (nhóm Ilb).
4. TỔNG HỢP HÓA HỌC4.1. Tổng hợp acid hydroxamic 4.1. Tổng hợp acid hydroxamic
Tồng hợp acid hydroxamic có thể đi tìr ester, clorid acid hoặc anhydrid acid. Phản ứng này diễn ra trong môi trường kiềm mạnh pH>10. Nếu dùng dung môi MeOH/nước
thì kiềm thường dùng LiOH, NaOH, K2CO3; nếu là dung môi khan thì dùng các amin
bậc 3 như TEA, pyridin). Tùy từng trường hợp mà điều kiện phản ứng cũng khác nhaụ U NH^OH-HCl
o KOfl/MeOH,rt, Ih °
Hình 10: Phản ứng điều chế SAHA từ methyl suberanilat
Với tác nhân là ester, trong môi trường kiềm mạnh ester dễ bị thủy phân thành acid carboxylic làm giảm hiệu suất phản ứng. Đã có nghiên cứu cho thấy thêm 1 lượng nhỏ KCN có thể làm tăng tốc độ phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester [29].
Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic rất khó xảy ra do acid carboxylic là tác nhân acyl hóa yểụ Vì vậy, cần thêm các xúc tác để hoạt hóa acid carboxylic, thường dùng một số tác nhân hoạt hóa mạnh như ĨỈBTU (2-(lH- Benzotriazole-l-yl)-l,l,3»3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HATU (2-(lH- 7-Azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate), HOBt (1- hydroxybenzotriazol)...[1 0, 1 1, 26, 28]
4.2. Acyl hóa amin bằng anhydrỉd acid
Anhydrid acid là tác nhân acyl hóa mạnh nên phản ứng dễ xảy rạ Xúc tác cho phản ứng acyl hóa bằng anhydride acid thường là amin bậc 3 như TEA, pyridin, quinolin... một số trưòng hợp có thể là carbonat kiềm hoặc kiềm.
/ ? R-. / w o R' — N H , H R " \+ ^N- I H R R R’- Ò ■-N- / H H o \\ o H R C O O H
HTinh 11: Cơ chế hoạt hóa anhydrid bằng pyridin
4.3. Acyl hóa amin bằng acid carboxyclic
Acid carbonxylic là tác nhân acyl hóa yếu, muốn thực hiện phản ứng cần có xúc tác có khả năng hoạt hóa mạnh. Các xúc tác hay dùng là CDI N,N-carbonyldimidazol, isobutylcloroformat, N-hydroxysuccinimid, HBTU (2-(lH-Benzotriazolẽl-yl)-l,l,33-
tetramethyluronium hexafluorophosphate, các carbodimid như DCC,
(dicyclohexylcarbodiimide), EDC (ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide)... R. + COa + Ị H I > H R ,N H 2 + R C O N H R
22
Phần II: NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯOXG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIÉT BỊ 2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Bao gồm:
- Hydroxylamin hydroclorid - Anhydrid succinic - Methyl 3-aminopropanoat - CDI (1, r -carbonyldiimidazol) - Các dẫn chất của anilin gồm: Anilin 4-methoxyanilin 4-cloroanilin 4- cyanoanilin
- Các hóa chất và dung môi khác cần cho tổng hợp: NaOH, DCM (dicloromethan),
DMF (N,N-dimethylformamid), MeOH (methanol), HCl, aceton.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), chị thị màu vạn năng.
- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.
- Nhiệt độ nóng chảy (t°nc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer - USA tại bộ môn Hóa vật liệu - Khoa hóa - Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nộị
- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của Viện hóa học Việt Nam và Khoa hóa - Trường đại học KHTNHN.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*H - NMR) và carbon ('^c - NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Tổng hợp N'-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N'^-phenylsuccinamid và dẫn chất. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.
Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng tế bào ung thư.
- Đánh giá liên quan cấu trúc-tác dụng theo sự thay đổi các nhóm thế và kết quả thử hoạt tính của các hợp chất tổng hợp được.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
- Tổng họp N^-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N"‘-phenylsuccinamid và 3 dẫn chất. - Kiểm tra độ tinh khiết.
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.
- Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng ung thư in vitro của 4 chất tổng hợp được. - Đánh giá liên quan cấu trúc-tác dụng giữa các dẫn chất không có nhóm thế, có
nhóm thế hút điện tử, đẩy điện tử thông qua IC50 và kết quả thử độc tính tế bàọ
2.3.1. Tổng hợp hóa học
- Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất thiết kế.
- Khảo sát và tiêu chuẩn hóa điều kiện phản ứng để thu được hiệu suất tối ưụ - Kiểm tra nhanh phản ứng bằng TLC
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy
2.3.2. Xác định cấu trúc
Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: Phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (^H - NMR), Phổ cộng hưởng từ carbon ('^C-NMR).
* Phổ hồng ngoại (IR): Phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa hóa, Trường đại học
24
6 0 0 c m 'Mầu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [2, 5, 6].
* Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng các chất He3-He4 được ghi tại Khoa hóa Trường đại học KHTN Hà Nội với chế độ đo EI, dung môi aceton. Phổ khối lượng của dãy Hal-Ha4 và Hel, He2 được ghi tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên -
Viện khoa học công nghệ Việt Nam với chế độ đo ESI, dung môi aceton.
* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*H - NMR) và phổ cộng hưởng từ carbon -
NMR) của dãy chất Hal-Ha4 được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam dùng dung môi DMSO, lấy mổc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.3.3. Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư
Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong rVSMCs. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so với mẫu trắng, chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bổ trước đây [4, 25].
2.3.3.Ị Phân lập histon và Western Blot
- Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào: tế bào ung thư trục tràng SW620 được phân
tán trong môi trường nuôi cấy DMEM gồm 2mM glutamine, 10% huyết thanh bào thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt cùng với 50U/ml penicillin và 50|ag/ml streptomicin. Dịch này được chia vào 96 lỗ của đĩa thử và điều chỉnh đến nồng độ tế bào/lỗ.
Tất cả tế bào được ủ trong 24h ở 37°c với không khí có chứa 5% (w/v) CO2 trước khi
thêm dung dịch của Hal-Ha4/DMS0. Các chất Hal-Ha4 được hòa tan trong DMSO tạo dung dịch gốc có nồng độ lOmM, bảo quản ở -80°c. Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường DMEM không có huyết thanh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ trong khoảng từ 0,1-100|^M. Nồng độ DMSO cuối cùng không vượt quá 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng
độ DMSO đúng bằng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử. Sau khi thêm dung dịch các Ha, tiếp tục ủ thêm 1 ngày, sau đó dùng các đĩa thử này để thực hiện các thử nghiệm tiếp theọ
- Phân lập histon và Western blot: các histon được phân lập bằng phương pháp
chiết acid. Chuẩn bị các đĩa thử có chứa mẫu thử và tế bào phân tán trong môi trường nuôi cấy (như trên), song song làm mẫu trắng (không có mẫu thử) và mẫu đối chiếu (chỉ có dung dịch chứa DMSO). Sau đó các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphatẹ rVSMCs được dung giải trong dung dịch dung giải đệm làm lạnh bằng nước đá [lOmM HEPES (PH 7,9); 1,5 lĩiM KCl, 0,5 mM DTT
và 1,5 mM phenylmethylsulfonylfluoride], sau đó 5M H2SO4 được thêm vàọ Sau khi ủ
trong đá 1 giờ, hỗn dịch được ly tâm và phần còn lại được thu hồi, trộn với acetone với tỷ lệ 9:1 sau đó giữ ở -20^c qua đêm. Sau khi ly tâm tiếp, phần cặn rắn được rửa bằng ethanol 70% và làm khô. Phân đoạn histon tan trong acid được hòa tan trong nước. Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp BCĂpierce), và histon được điện di qua gel SDS-PAGE 15% và chuyển vào lớp màng PVDF. Các màng được ủ cùng histon kháng acetyl hóa H3, H4 (Upstage Biotechnology), tiếp theo là kháng thể liên hợp peroxidase của ngựạ Các dải có phản ứng dưcmg tính được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cường. Một kháng thể thứ cấp được đánh giá bằng sự phát quang có kích hoạt. Các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.
Ị3.3.2. Thử độc tính tế bào in vitro:
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vỉtro được thực hiện tại Khoa Dược, Trưòfng Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT. Dòng tế bào thử nghiệm là tế bào ung thư đại tràng SW620.
MTT ((3-(4.5-dimethylthiazol-2-vl)-2.5-diphenvltetrazolium bromide) là 1 thuốc nhuộm tan trong nước, khi được hòa tan trong tế bào sống có sẽ tạo thành formazan có màu tím và không tan trong nước. Như vậy dựa vào phép đo màu MTT có thể xác định được số lượng tể bào sống trong phép thử độc tính tế bàọ
26
Các đĩa tế bào sau khi ủ 1 ngày với các dẫn chất Ha được nhuộm trong 3 giờ với dung dịch MTT/đệm phosphat đẳng trương (nồng độ 5mg/ml). Sau đó rửa sạch MTT còn lại bằng nước (không rửa với đệm phosphat đẳng trương), Phần thuốc nhuộm đã liên kết với tế bào sóng được chiết bằng isopropanol acid hóa hoặc DMSO rồi được đem đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 550 nm. Kết quả cuối cùng được tính theo kết quả trung bình của 4 lần thử độc lập với nhaụ
Giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probit. Theo phép thử này, nếu kết quả IC50< 30|ig/ml thì được coi là có hoạt tính.
2.3.4. Đánh giá mổí ỉiên quan cấu trúc - tác dụng
Dựa vào kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC, giá trị IC50 thu được có thể xác định
sơ bộ mối tương quan giữa hoạt tính và các nhóm chức thế khác nhau, so sánh hoạt tính giữa họp chất không có nhóm thế, có nhóm thế hút điện tử và có nhóm thế đẩy điện tử.
P H Ầ N 3: T H Ụ C N G ĨỆ M - K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N
3.1. HÓA HỌC
3.1.1. TỐNG HỢP HÓA HỌC
3.1.1.1. Tổng họp acid 4-oxo-4-(phenylammo)butanoic và dẫn chất (dãy H1-H4) > Quy trình chung:
Quá trình tổng hợp các dẫn chất H1-H4 được tiến hành theo khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học khóa 2005-2010 của dược sỹ Phan Nữ Nguyệt Thịnh [4]:
,o ^NHCOCHaCHaCOOH ,NHj P o D M F pyridin
Sơ đồ 1: Tổng hợp các dẫn chất của acid 4-phenylamino-4-oxobutanoic
Trong đó:
Chât R Chât R
HI H- H3 CH3O-
H2 Cl- H4 CN-
Tiến hành chung:
Thực hiện phản ứng: Bình cầu, con khuấy rửa sạch, sấy khô ở 60°c trong 2-3h. Cân
1 lượng khoảng 5mmol (500mg) anhydrid succinic, 5mmol dẫn chất của anilin, đong 4ml DMF và 0,5ml pyíidin cho vào bình cầu 50 ml có nút màị Đặt bình cầu lên máy khuấy từ (số vòng quay 300 vòng/phút). Gia nhiệt và duy trì nhiệt độ phản ứn ở 50°c trong vòng 24-48h. Sau 24h kiểm tra phản ứng bằng TCL với hệ dung