Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch trích - Dung dịch NaOH 0,1N.
- Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). - Dung dịch B (CuSO4).
- Dung dịch C (A : B = 45 : 5). - Dung dịch Folin 1N.
22
- Cân 10mg nội nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml, thêm vào 1 ml NaOH 0,1N.
- Khuấy đều và để qua đêm.
Bƣớc 3: Pha loãng mẫu và đo
- Khuấy đều mẫu bằng máy Vortex sau đó ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút 100 μl dịch trích cho vào ống 10 ml (đối với mẫu blank thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 0,1N.
- Thêm 1 ml nước cất, lắc đều.
- Thêm 500 μl dung dịch C (chỉ pha trước khi sử dụng 30 phút), lắc đều và để yên trong 10 phút.
- Thêm 50 μl Folin 1N, lắc đều và để yên trong 30 phút. Sau đó cho vào cuvette và đo ở bước sóng 600nm.
Bƣớc 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
- Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). - Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b
- Trong đó Y: Độ hấp thụ OD.
X: Nồng độ protein có trong mẫu đem đo (mg/ml). - Hàm lượng protein được tính theo công thức:
Protein (%) = 𝑋 𝑥 10 𝑚 𝑥 100 m = 10 𝑥 (100−𝐻%) 100−14 H%: độ ẩm của mẫu 2.3.4.6 Màu sắc hạt gạo
- Màu sắc hạt gạo: lột vỏ trấu, quan sát màu sắc hạt gạo và miêu tả.
2.3.5 Đánh giá khả năng chịu mặn
- Giống chuẩn nhiễm: IR28. - Giống chuẩn kháng: Đốc phụng.
23
- Khay nhựa hình chữ nhật kích thước 14 x 30 x 35. - Lưới chống muỗi.
- Tấm xốp dày khoảng 1,2-2,5 cm. - Muối NaCl.
- Dung dịch Yoshida. - Máy đo nồng độ muối.
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Hạt giống thử nghiệm phải được xử lý nhiệt trong 5 ngày trong tủ sấy ở nhiệt độ 500C để phá miên trạng của hạt giống. Sau khi phá miên trạng, khử trùng hạt giống với thuốc diệt nấm và rửa sạch với nước cất. Đặt hạt tiệt trùng trong đĩa petri với giấy lọc và ủ ở 300C trong 48h để lúa nảy mầm.
Bƣớc 2: Gieo 2 hạt nảy mầm trên mỗi lỗ trên các tấm xốp (10 lỗ tương ứng với 20 hạt/giống/dòng). Trong 3 ngày đầu chỉ để cây con trên khay xốp chứa đầy nước cất giữ cây con nguyên vẹn, hạn chế tác động đến cây con. Bất kỳ thiệt hại nào cho các rễ nhỏ, chồi sẽ phá hủy các cơ chế chịu mặn chính của lúa.
Bƣớc 3: Sau 3 ngày, khi cây con phát triển tốt, thay thế nước cất với dung dịch dinh dưỡng thử mặn. Hằng ngày kiểm tra mực nước, thêm nước cất đúng 3 lít vào các khay thử mặn.
Bƣớc 4: Đổi mới mỗi 8 ngày các dung dịch dinh dưỡng và duy trì độ pH 5,0 hàng ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi:
Thường xuyên theo dõi thí nghiệm, đến khi giống chuẩn nhiễm (IR28) gần như chết hoàn toàn (cấp 9).
24
Đánh giá cấp chống chịu mặn: sử dụng tiêu chuẩn đánh giá của IRRI (1997) để đánh giá khả năng chống chịu mặn ở Bảng 2.6
Bảng 2.6 Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển (IRRI, 1997)
Cấp Mô tả triệu chứng Đánh giá
1 Tăng trưởng bình thường không có vết cháy lá Chống chịu tốt 3 Gần như bình thường, nhưng đầu lá hoặc vài lá có vết
trắng, lá hơi cuốn lại Chống chịu
5 Tăng trưởng chậm, hết lá bị khô, một vài chồi bị chết Chống chịu trung bình 7 Tăng trưởng bị ngưng lại hoàn toàn, hầu hết lá bị khô,
một vài cây bị chết Nhiễm
9 Tất cả cây bị chết hoặc khô Rất nhiễm
2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng rầy
- Giống chuẩn nhiễm: TN1. - Giống chuẩn kháng: BN2.
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Rầy nâu được nuôi trên khay lúa 30 ngày tuổi. Giống lúa được dùng để nuôi rầy là TN1. Khay dùng nuôi rầy có kích thước 30x15 cm. Mỗi khay trồng 5-7 bụi lúa. Những khay lúa này được đặt trong tủ có lưới kín bao xung quanh bên trong khay nhựa có chứa đất và một lớp nước khoảng 2-3 cm nhằm tạo độ ẩm cho rầy phát triển. Mỗi ngăn tủ có khoảng 3-5 khay. Trước khi thả rầy vào cần làm sạch gốc lúa, cắt bỏ những bẹ lá già, bẹ gần sát mặt nước.
Sau khi chuẩn bị khay nuôi rầy, tiến hành bắt rầy cái thả vào. Thông thường một rầy cái cánh ngắn có thể đẻ được 300-400 trứng, rầy cánh dài có thể đẻ được 100 trứng.
Bƣớc 2: Hai ngày sau khi thả rầy, tiến hành gieo trồng lúa (đã được ngâm ủ bình thường) vào khay nhựa 25x30 cm có chứa sẵn một lớp đất dày 5 cm. Gieo ngẫu nhiên từng giống/dòng xử lý đột biến, đối chứng, chuẩn kháng, chuẩn nhiễm, mỗi giống/dòng gieo một hàng khoảng 15-20 cây.
Bƣớc 3: Khi lúa được 2-3 lá thật (5-7 ngày tuổi), tiến hành bắt rầy tuổi 1-2 thả vào, mật độ 5-8 con/cây.
25
Chỉ tiêu theo dõi:
Lấy chỉ tiêu khi trên 95% giống lúa chuẩn nhiễm chết. Khả năng kháng rầy được đánh giá theo tiêu chuẩn đánh giá quốc tế ở Bảng 2.7
Bảng 2.7 Bảng đánh giá khả năng kháng rầy theo IRRI (1996)
Cấp Biểu hiện
0 Không thiệt hại 1 Thiệt hại nhẹ
3 Lá thứ 1 và thứ 2 của hầu hết các cây bị vàng một phần 5 Cây vàng, phân nữa số cây héo hoặc chết
7 Hơn phân nữa số cây chết, còn lại còi cọc nặn 9 Tất cả mọi cây đều chết
Bảng 2.8 Tiêu chuẩn đánh giá khả năng kháng rầy theo IRRI (1996)
Cấp Đánh giá <1 Rất kháng 1,0 – 3,0 Kháng 3,1 – 4,5 Kháng vừa 4,6 – 5,5 Nhiễm vừa 5,6 – 7,0 Nhiễm 7,1 – 9,0 Nhiễm nặng 2.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
26
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THẾ HỆ M1
3.1.1 Ghi nhận chung
Sau khi xử lý nhiệt 100 hạt giống, tiến hành đem trồng trong nhà lưới vào ngày 01/03/2013 (có đối chứng). Chăm sóc, theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu nông học của từng cá thể. Đến giai đoạn trổ, chọn được 1 cá thể trổ sớm trước đối chứng.
3.1.2 Một số chỉ tiêu nông học của các cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt thế hệ M1
Bảng 3.1 Thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số bông/bụi của một cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt trổ sớm ở thế hệ M1
STT Tên giống/dòng TGST (ngày) Cao cây (cm) Số bông/bụi
1 TNĐĐB 1 121 120 2
2 ĐỐI CHỨNG Không trổ - -
TNĐĐB: Tài Nguyên Đục đột biến; TGST: Thời gian sinh trưởng; Đối chứng là giống Tài Nguyên Đục không xử lý nhiệt.
* Thời gian sinh trưởng
Qua kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy cá thể Tài Nguyên Đục đột biến có thời gian sinh trưởng ngắn (121 ngày), trong khi giống đối chứng bị quang cảm nên không trổ.
Theo Võ Tòng Xuân (1979), các giống lúa có thời gian sinh trưởng từ 110 đến 135 ngày luôn cho năng suất cao hơn các giống chín sớm hơn và các giống chín muộn hơn ở phần lớn các điều kiện canh tác, do đó cá thể trổ sớm duy nhất có tìm năng năng suất cao. Nhìn chung thời gian sinh trưởng của cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt còn dài nhưng cũng đã rút ngắn rất nhiều so với giống gốc. Điều này cho thấy phương pháp sốc nhiệt có khả năng rút ngắn thời gian sinh trưởng của giống lúa mùa Tài Nguyên Đục.
* Chiều cao cây
Qua kết quả trình bày ở bảng 3.1 cho thấy cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt có chiều cao cây thấp (120 cm), và thấp hơn nhiều so với giống Tài Nguyên Đục không xử lý nhiệt.
Akita (1989) cho rằng cây lúa cao từ 90-100 cm được coi là lý tưởng về năng suất. Việc hạn chế chiều cao cây có ý nghĩa quan trọng đối với một giống lúa, nó góp phần giảm sự đổ ngã và làm tăng năng suất (Jennings và ctv., 1979). Theo
27
kết quả trên bước đầu có thể đánh giá các cá thể đột biến được chọn có biểu hiện rút ngắn về chiều cao cây, tạo tiềm năng kháng đổ ngã và gia tăng năng suất.
* Số bông trên bụi
Qua bảng 3.1 cho thấy cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt có số bông trên bụi rất thấp chỉ có 2 bông trên bụi.
Nguyễn Đình Giao và ctv. (1997) cho rằng trong bốn yếu tố tạo thành năng suất thì số bông trên bụi là yếu tố quyết định nhất và sớm nhất. Nó có thể đóng góp 74% năng suất. Lúa mùa có thời gian sinh trưởng khá dài, cao cây, dễ đổ ngã và bị các loài sâu bệnh tấn công. Ở vụ này, giống đối chứng và các cá thể xử lý nhiệt bị bệnh vàng lá chín sớm nên ảnh hưởng nhiều đến năng suất.
Bảng 3.2 Trọng lượng 1000 hạt, chiều dài bông, số hạt chắc trên bông và tỷ lệ hạt chắc của cá
thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt ở thế hệ M1
STT Tên giống/dòng TL 1000 hạt Chiều dài bông (cm) Số hạt chắc/bông Tỷ lệ hạt chắc (%) 1 TNĐĐB 1 24,5 26,0 100 85,0 2 ĐỐI CHỨNG - - - -
TNĐĐB: Tài Nguyên Đục đột biến; Đối chứng là giống Tài Nguyên Đục không xử lý nhiệt; TL: Trọng lượng.
* Trọng lượng 1000 hạt
Qua Bảng 3.2 cho thấy cá thể TNĐĐB 1 có trọng lượng 1000 hạt trung bình là 24,5 g
Theo Nguyễn Đình Giao và ctv. (1997), trọng lượng 1000 hạt cũng là một đặc tính quan trọng góp phần nâng cao năng suất lúa, trọng lượng 1000 hạt ít chịu tác động của môi trường do có hệ số di truyền cao, nên việc chọn ra giống có trọng lượng 1000 hạt cao là rất cần thiết để nâng cao năng suất.
* Chiều dài bông
Kết quả Bảng 3.2 cho thấy cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt có chiều dài bông trung bình (24,5 cm).
Theo Sykudo (1985) được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Mỹ Phương (2006), tính trạng chiều dài bông lúa do khoảng sáu gen kiểm soát và phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Điều đó cho thấy rằng, không có sự thay đổi trong cơ chế biểu hiện của các gen kiểm soát chiều dài bông của cá thể đột biến ở thế hệ này.
28
Qua kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt có số hạt trên bông cao (100 hạt) và tỷ lệ hạt chắc cao (85%).
Nguyễn Ngọc Đệ (2008) cho rằng lúa sạ có trung bình từ 80-100 hạt trên bông và 100-120 hạt trên bông đối với lúa cấy được xem là tốt trong điều kiện Đồng Bằng Sông Cửu Long. Thường số hoa trên bông quá nhiều dẫn đến tỷ lệ hạt chắc thấp. Muốn có năng suất cao, tỷ lệ hạt chắc phải đạt trên 80% (Nguyễn Ngọc Đệ, 1998). Kết quả trên cho thấy, cá thể xử lý nhiệt có tiềm năng cho năng suất cao.
3.2 THẾ HỆ M2
3.2.1 Ghi nhận chung
Cá thể trổ sớ m duy nhất ở thế hệ M1 được nhân dòng lên trong nhà lưới cùng với giống đối chứng Tài Nguyên Đục.
Chăm sóc, ghi nhận các chỉ tiêu nông học, chọn lọc những cá thể theo hướng thời gian sinh trưởng ngắn. Kết quả thu được 4 cá thể có thời gian sinh trưởng ngắn hơn so với đối chứng.
3.2.2 Một số chỉ tiêu nông học của các cá thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt thế hệ M2
Bảng 3.3Thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số bông/bụi của các cá thể Tài Nguyên Đục xử
lý nhiệt ở thế hệ M2
STT Tên giống/dòng TGST (ngày) Chiều cao cây
(cm) Số bông/bụi 1 TNĐĐB 1-1 102 93 14 2 TNĐĐB 1-2 107 99 15 3 TNĐĐB 1-3 110 95 12 4 TNĐĐB 1-4 107 96 14 5 ĐỐI CHỨNG Không trổ - -
TNĐĐB: Tài Nguyên Đục đột biến; TGST: Thời gian sinh trưởng; Đối chứng là giống Tài Nguyên Đục không xử lý nhiệt.
* Thời gian sinh trưởng
Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy thời gian sinh trưởng của các cá thể đột biến dao động trong khoảng 102-110 ngày trong khi giống đối chứng bị quang cảm nên không trổ.
Nguyễn Ngọc Đệ (2008) cho rằng thời gian sinh trưởng được tính từ lúc hạt nảy mầm đến khi thu hoạch. So với thế hệ M1 thì thời gian sinh trưởng của các cá
29
thể đột biến ở thế hệ M2 đã ngắn hơn rất nhiều. Mặc dù Tài Nguyên Đục là giống lúa mùa, là nhóm lúa có cảm ứng với quang kỳ, chỉ ra hoa trong điều kiện ánh sáng ngày ngắn, tức chỉ trổ và chín theo mùa (Trần Hữu Phúc, 2008) nhưng các cá thể đột biến ở thế hệ M2 đã trổ sớm mặc dù thí nghiệm được bố trí nghịch vụ của các giống lúa mùa. Kết quả trên cho thấy phương pháp sốc nhiệt có khả năng phá quang kỳ giống lúa mùa Tài Nguyên Đục.
* Chiều cao cây
Qua Bảng 3.3 cho thấy các cá thể đột biến thu được có chiều cao trung bình trong hoảng 93-99 cm. So với thế hệ M1 thì chiều cao cây của các cá th ể thế hệ M2
có phần thấp hơn.
Chiều cao cây là một trong những chỉ tiêu quan trọng góp phần nâng cao năng suất cây lúa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Việc biểu hiện kiểu hình thấp cây ở các cá thể đột biến so với đối chứng Tài Nguyên Đục nhằm tạo khả năng tăng quang hợp, hấp thụ dưỡng chất và kháng đỗ ngã góp phần làm gia tăng năng suất. Kết quả trên cho thấy phương pháp sốc nhiệt có hiệu quả trên tính trạng chiều cao cây đối với giống lúa Tài Nguyên Đục.
* Số bông trên bụi
Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy các cá thể đột biến có số bông trên bụi biến thiên trong khoảng 12-15 bông, cá thể có số bông trên bụi cao nhất là TNĐĐB 1-2 có 15 bông, cá thể có số bông trên bụi thấp nhất là TNĐĐB 1-3 có 12 bông.
Nguyễn Đình Giao và ctv. (1997) cho rằng trong bốn yếu tố tạo thành năng suất thì số bông trên bụi là yếu tố quyết định nhất và sớm nhất. Nó có thể đóng góp 74% năng suất. So với thế hệ M1, các cá thể đột biến ở thế hệ M2 có số bông trên bụi nhiều hơn đáng kể.
Bảng 3.4 Trọng lượng 1000 hạt, chiều dài bông, số hạt chắc trên bông và tỷ lệ hạt chắc của cá
thể Tài Nguyên Đục xử lý nhiệt ở thế hệ M2
STT Tên giống/dòng TL 1000 hạt (g) Dài bông (cm) Hạt chắc/bông Tỷ lệ hạt chắc (%) 1 TNĐĐB 1-1 25,5 23,5 105 79,6 2 TNĐĐB 1-2 24,7 24,0 110 81,0 3 TNĐĐB 1-3 25,0 24,4 100 77,5 4 TNĐĐB 1-4 25,7 24,8 95 78,5 5 ĐỐI CHỨNG - - - -
30
TNĐĐB: Tài Nguyên Đục đột biến; Đối chứng là giống Tài Nguyên Đục không xử lý nhiệt; TL: Trọng lượng.
* Trọng lượng 1000 hạt
Qua Bảng 3.4 cho thấy trọng lượng 1000 hạt của các cá thể đột biến dao động trong khoảng 24,7-25,7 g. Trong đó cá thể có trọng lượng 1000 hạt cao nhất là TNĐĐB 1-4 (25,7 g), cá thể có trọng lượng 1000 hạt thấp nhất là TNĐĐB 1-2 (24,7 g).
Trọng lượng 1000 hạt do hai yếu tố cầu thành, khối lượng vỏ trấu chiếm 20% và khối lượng hạt gạo chiếm 80% (Nguyễn Đình Giao và ctv., 1997). Vì vậy, cần chọn tạo ra những giống có khối lượng hạt cao để gia tăng năng suất. Trọng lượng 1000 hạt của thế hệ này so với thế hệ trước là khá ổn định. Điều này nói lên các cá thể ở thế hệ M2 (hạt M3) có tiềm năng năng suất cao và ổn định.
* Chiều dài bông
Kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy chiều dài bông của các cá thể đột biến thế hệ M2 biến thiên trong khoảng 23,5-24,8 cm. Trong đó cá thể có chiều dài bông cao nhất là TNĐĐB 1-4 (24,8 cm), cá thể có chiều dài bông thấp nhất là TNĐĐB 1-1 (23,5 cm).
Chiều dài bông do đặc tính di truyền quyết định nhưng cũng một phần chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nhất là điều kiện dinh dưỡng trong giai đoạn đầu hình thành bông. Nhìn chung chiều dài bông ở thế hệ này không khác nhiều so với thế hệ M1.
* Số hạt chắc trên bông và tỷ lệ hạt chắc
Kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy số hạt chắc trên bông của các cá thể đột biến