a. Chuyển gen miraculin lên cây rau diếp
Năm 2006 đã c báo cáo việc sử dụng một hệ thống biểu hiện cây trồng để sản xuất miraculin. Một gen mã hóa tổng hợp miraculin đã đƣợc đặt dƣới sự kiểm soát của các promoters cấu tạo và chuyển giao cho rau diếp. Biểu hiện của gen này trong rau diếp biến đổi gen dẫn đến sự tích tụ của một lƣợng đáng kể protein miraculin trong lá. Các miraculin thể hiện trong rau diếp biến đổi gen đã gây ra hoạt động vị ngọt ngào (Sun et al., 2006).
Những kết quả này chứng minh rằng việc sản xuất miraculin trong thực vật ăn đƣợc có thể là một chiến lƣợc thay thế tốt để tăng cƣờng sự sẵn có của protein này. Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đã cố gắng để thể hiện các protein hƣơng vị thay đổi, miraculin, trong rau diếp nhƣ một chất làm ngọt thay thế tiềm năng. Rau diếp là một cây trồng nông nghiệp đƣợc trồng rộng rãi trên toàn thế giới. Một mã hóa gen miraculin tổng hợp đã đƣợc lắp ráp và đƣa vào vector biểu hiện của thực vật. Miraculin tái tổ hợp đã đƣợc bày tỏ trong rau diếp biến đổi gen và cho thấy hoạt động ngọt ngào, lôi kéo mạnh mẽ. Theo tìm hiểu của các nhà nghiên cứu, đây là báo cáo đầu tiên về sản xuất dƣới dạng hoạt tính sinh học của miraculin trong một vật chủ nƣớc ngoài (Sun et al., 2006).
b. Chuyển gen miraculin vào Aspergillus oryzae
Để c đƣợc một lƣợng vừa đủ miraculin để kiểm tra các cơ chế liên quan trƣờng hợp cảm quan ở cấp mức phân tử, các nhà khoa học chuyển Aspergillus oryzae bằng cách đƣa gen miraculin năm 2008. Biến nạp đƣợc thể hiện và tiết ra một Hình thức cảm quan hoạt động của miraculin với hàm lƣợng 2 mg/l. Kết quả
cho thấy rằng 0,5 mg/mlmiraculin tái tổ hợp tƣơng đƣơng với 0,1 mg/ml miraculin về hoạt động nếm sửa đổi vị ở pH=3,0 (Ito et al., 2008).
c. Chuyển gen miraculin lên dây tây
Năm 2008, các gen mã h a protein miraculin hƣơng vị thay đổi đã đƣợc giới thiệu dƣới sự kiểm soát của promoter 35S hoặc El2 vào dâu tây (Fragaria x ananassa) bởi Agrobacterium để sản xuất cây chuyển gen. Mặc dù miraculin đã đƣợc phát hiện trong lá và quả của cây chuyển gen, mức độ tích tụ trong các dòng biến đổi gen, mà dao động từ 0,5 đến 2,0 μg/g trái cây tƣơi, không khác nhau đáng kể và thấp hơn so với trong trái cây thần kỳ (145 μg/g trái cây tƣơi . Mức độ cao của sự tích tụ miraculin đã đƣợc phát hiện trong các loại trái cây trƣởng thành. Các dòng biến đổi gen sau đ đƣợc truyền thông qua các vận động viên cho ba thế hệ thực vật, và miraculin đã đƣợc phát hiện ở mức độ bình đẳng trong lá và quả của cây từ mỗi thế hệ. Trong kết luận, mặc dù mức độ t ch lũy là không cao, miraculin đã đƣợc ổn định thể hiện và t ch lũy trong các thế hệ con cháu sinh dƣ ng của cây dâu tây biến đổi gen (Sugaya et al., 2008).
d. Chuyển gen miraculin lên cà chua
Cà chua là một loại rau quả ch nh đƣợc trồng khắp thế giới, và yêu cầu tăng trƣởng của n là đƣợc hiểu rõ. Vì vậy, các nhà khoa học quyết định sản xuất miraculin tái tổ hợp trong cà chua biến đổi gen. Các nhà khoa học phát triển cây cà chua biến đổi gen tích tụ một lƣợng lớn protein miraculin (Sun et al., 2007) và các protein đƣợc sản xuất gần nhƣ cùng một mức độ hƣơng vị thay đổi hoạt động nhƣ miraculin có nguồn gốc từ trái cây thần kỳ. Nghiên cứu này cho thấy rằng gen miraculin thừa kế và biểu hiện ổn định qua nhiều thế hệ trong cà chua biến đổi gen. Tóm lại, các nghiên cứu cho rằng cà chua là một nền tảng tiềm năng cho sản xuất hàng loạt miraculin (Kim et al., 2010 . Nhƣ vậy, các nhà khoa học đã sản xuất miraculin tái tổ hợp trong rau diếp biến đổi gen (Sun et al., 2006), chuyển gen cà chua (Sun et al., 2007; Sugaya et al., 2008) và dâu tây biến đổi gen (Sugaya et al., 2008). Trong số những cây chuyển gen, cà chua đƣợc ăn ở nhiều nƣớc và có nhiều tiềm năng cho năng suất (Hirai et al., 2010).
e. Tách chiết hoạt chất miraculin trong trái thần kỳ
Miraculin là protein thay đổi hƣơng vị đặc t nh đặc biệt này là có thể thay đổi vị chua thành ngọt. Ch nh đặc t nh đặc biệt này n đã đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Năm 2010, Trần Danh Thế và cộng sự đã nghiên cứu trồng thử nghiệm cây thần kỳ trong điều kiện khí hậu, thỗ nhƣ ng tại Thành phố Hồ Chí Minh và tách chiết hoạt chất miraculin trong dung dịch muối loãng bằng phƣơng pháp trao đổi ion. Kết quả ghi nhận miraculin thu đƣợc c độ tinh sạch cao và có khả năng biến đổi vị chua của acid citric trở nên ngọt tƣơng đƣơng với độ ngọt của saccharose 0,4 M.
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1 Địa điểm và thời gian
Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian tiến hành thí nghiệm: Từ 8/2014 đến 12/2014.
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Máy sấy thăng hoa Virtric – Bench Top từ Mỹ Tủ đông hiệu Sanyo xuất xứ từ Japan
Cân điện tử OHYO xuất xứ từ Japan Máy ép trái cây
Thƣớc kẹp Ống đong
Một số dụng cụ thủy tinh và những dụng cụ thí nghiệm thông thƣờng
3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất
a. Nguyên vật liệu
Trái thần kỳ V nh Long Nƣớc cam ép Berry (Úc)
Cà phê Trung Nguyên (Việt Nam) Maltodextrin (Trung Quốc)
Tinh bột bắp Bột sắn dây Tinh bột biến tính
b. Hóa chất
Đƣờng tinh luyện Biên Hòa (Việt Nam) Muối NaCl (Trung Quốc)
Caffeine (C8H10N4O2) (Ấn Độ) Acid citric (C6H8O7.H2O) (Ấn Độ)
3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM
3.2.1 Quy trình tham khảo tạo ra bột quả thần kỳ
Hình 3.1 Quy trình tham khảo tạo ra bột quả thần kỳ
Quả thần kỳ Xử lí, làm sạch Tách bỏ hạt Thịt quả Ép Dịch quả Phối trộn Chất bổ sung Lạnh đông
Sấy thăng hoa Bột quả
thần kỳ Bổ sung nƣớc
Lọc Xác thịt quả
3.2.2 Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu trái thần kỳ đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, tiến hành xử lí làm sạch tách bỏ hạt lấy phần thịt. Mỗi mẫu sử dụng 100 g thịt quả, sau đ tiến hành ép tách dịch quả (bằng máy ép trái cây). Phần xác quả đƣợc thêm nƣớc lƣợng nƣớc sử dụng 50% so với thịt quả để trích ly, dịch trích ly bổ sung chung vào dịch quả. Kết hợp với chất bổ sung, hỗn hợp đƣợc thanh trùng bằng NaHSO3 (124 mg/l) trong 30 phút (Nguyễn Minh Thủy, 2011). Tổng khối lƣợng hỗn hợp đƣợc lạnh đông trong thời gian 2 ngày. Mẫu đƣợc sấy thăng hoa ở nhiệt độ -69,5 oC trong vòng 72 giờ. Sau khi sấy đông khô thu đƣợc bột quả thần kỳ, đ ng g i và bảo quản.
3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của loại chất bổ sung đến khả năng chế biến bột quả thần kỳ bột quả thần kỳ
ục ch th nghiệm Xác định chất bổ sung th ch hợp và hiệu quả cho chế biến bột quả thần kỳ.
ố tr th nghiệm
Th nghiệm đƣợc bố tr theo một nhân tố, 2 lần lặp lại: Nhân tố A: Loại chất bổ sung (tỷ lệ 30% so với dịch quả): A1: Tinh bột bắp A2: Tinh bột biến tính
A3: Maltodextrin A4: Tinh bột sắn dây Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức
Số mẫu thí nghiệm: 4×2 = 8 mẫu
Tiến h nh th nghiệm Trái thần kỳ sau khi rửa sạch đƣợc tr ch tách dịch quả. Cho chất sung bột vào dịch quả, khuấy đều và lạnh đông sâu trong 2 ngày sau đ đƣợc sấy đông khô để tạo bột quả thần kỳ.
h tiêu ph n t ch Hiệu suất thu hồi , khả năng tạo bột và đặc t nh cảm quan của bột, khả năng duy trì hoạt t nh miraculin.
3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất bổ sung đến khả năng chế biến bột quả thần kỳ biến bột quả thần kỳ
Mục ch thí nghiệm: Xác định nồng độ chất bổ sung vào dịch quả thần kỳ để thu bột quả có chất lƣợng tốt.
Nhân tố B: Tỷ lệ chất bổ sung sử dụng , so với dịch quả, chất bổ sung đƣợc lựa chọn từ kết quả tối ƣu của thí nghiệm 3.3.1), thay đổi ở 5 mức độ
B1: 10% B2: 15% B3: 20% B4: 25% B5: 30% Tổng số nghiệm thức: 5 nghiệm thức.
Số mẫu thí nghiệm: 5×3 = 15 mẫu.
Tiến hành thí nghiệm: Trái thần kỳ sau khi rửa sạch đƣợc tr ch tách dịch quả. Sau đ cho vào chất bổ sung vào dịch quả theo tỷ lệ khối lƣợng ứng với từng nồng độ thử nghiệm. Hỗn hợp dịch với maltodextrin vừa bổ sung đƣợc thanh trùng bằng NaHSO3 (124 mg/l) trong 30 phút (Nguyễn Minh Thủy, 2011 và lạnh đông sâu trong vòng 2 ngày. Cuối cùng đƣợc sấy thăng hoa trong 72 giờ để thu bột quả, cho vào bao PE ghép m và bảo quản.
h tiêu ph n t ch Hiệu suất thu hồi , khả năng tạo bột và đặc t nh cảm quan của bột, khả năng duy trì hoạt t nh miraculin thông qua sự thay đổi ngƣ ng cảm phân biệt trên bốn vị cơ bản.
Sự thay đổi ngƣ ng cảm phân biệt của bốn vị cơ bản đƣợc tiến hành xác định bằng phƣơng pháp pha loãng đƣợc trình bày ở mục 3.4.2 a.
3.3.3 Đánh giá ảnh hƣởng của bột quả thần kỳ trên sản phẩm nƣớc cam ép
Mục ch thí nghiệm: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính cảm quan khi bổ sung bột quả thần kỳ vào nƣớc cam ép và khả năng chấp nhận nƣớc cam ép.
Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị 4 mẫu nƣớc cam có pha bột quả thần kỳ theo nồng độ tăng dần (0%, 1,5%, 2%, 2,5%) từ trƣớc và c đánh dấu bằng các số ngẫu nhiên, 5 mẫu đƣợc pha nhƣ Bảng 3.3.
Bảng 3.1 Bảng pha mẫu nƣớc cam ép có bổ sung bột quả thần kỳ
Bố trí thí nghiệm: Nồng độ bột quả thần kỳ đƣợc bố trí với 4 mức nồng độ. D1: 0% (mẫu đối chứng) D2: 1,5% D3: 2,0% D4: 2,5%
Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức
Thành phần Hàm lƣợng
Nƣớc cam ép (ml) 100 100 100 100
Thí nghiệm đƣợc bố tr theo sơ đồ Hình 3.2.
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của bột quả thần kỳ đến giá trị cảm quan nƣớc cam ép
Tiến hành: Thí nghiệm đƣợc bố tr theo phƣơng pháp phân t ch mô tả định lƣợng QDA. Hội đồng gồm có 10 thành viên, mỗi thành viên sẽ tiến hành đánh giá cảm quan. Các thành viên thử lần lƣợt các mẫu theo thứ tự nồng độ bột quả thần kỳ tăng dần, ghi nhận về mùi, vị, trạng thái và màu sắc của từng mẫu thử và cho điểm mỗi thuộc t nh theo thang điểm cƣờng độ từ 5 giảm dần xuống 0. Đồng thời tiến hành ghi nhận về khả năng chấp nhận của từng cảm quan viên về 4 mẫu.
Ch tiêu theo dõi: Mùi, vị, màu sắc và trạng thái.
3.4.4 Đánh giá ảnh hƣởng bột quả thần kỳ trên sản phẩm nƣớc cà phê
Mục ch: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính cảm quan khi bổ sung bột quả thần kỳ vào nƣớc cà phê để thay thế một phần đƣờng sử dụng và khả năng chấp nhận nƣớc cà phê.
Chuẩn bị mẫu: Cà phê sử dụng là cà phê Trung Nguyên loại pha phin, tiến hành pha theo công thức trên bao bì, cho 200 gam cà phê rang xay vào phin nhôm, đổ 20 ml nƣớc 80 đến 90 o
C) vào cho cà phê ngấm đều. Tiếp tục cho khoảng 80 ml nƣớc sôi vào và chờ cho cà phê nhỏ giọt ra.
Chuẩn bị 5 mẫu cà phê đã bổ sung bột quả thần kỳ theo nồng độ tăng dần (0%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%) và đƣợc bổ sung thay thế một phần đƣờng sử dụng, mẫu đƣợc đánh số ngẫu nhiên.
Bố trí thí nghiệm: Bột quả thần kỳ chế biến bằng phƣơng pháp bổ sung maltodextrin mẫu tốt nhất từ kết quả th nghiệm 3.3.2), đƣợc bổ sung thay thế đƣờng trong 100 ml cà phê với các mức nhƣ sau:
Nƣớc cam ép (Berry)
Bổ sung bột quả thần kỳ
D1 D2 D3 D4
E1: 0 g bột thần kỳ (0%) + 20 g đƣờng E2: 1 g bột thần kỳ 1 + 15 g đƣờng E3: 1,5 g bột thần kỳ (1,5%) + 10 g đƣờng E4: 2 g bột thần kỳ 2 + 5 g đƣờng E5: 2,5 g bột thần kỳ 2,5 + 0 g đƣờng Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ sau:
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của bột quả thần kỳ đến giá trị cảm quan nƣớc cà phê
Tiến hành: Thí nghiệm đƣợc bố tr theo phƣơng pháp phân t ch mô tả định lƣợng QDA. Hội đồng gồm có 10 thành viên, mỗi thành viên sẽ tiến hành đánh giá cảm quan. Các thành viên thử lần lƣợt các mẫu theo thứ tự nồng độ bột quả thần kỳ tăng dần, ghi nhận về mùi, vị, trạng thái và màu sắc của từng mẫu thử. Đồng thời tiến hành ghi nhận về khả năng chấp nhận của từng cảm quan viên về 5 mẫu.
3.4 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU 3.4.1 Phân tích đặc tính vật lý nguyên liệu 3.4.1 Phân tích đặc tính vật lý nguyên liệu
Xác định khối lƣợng bằng cân điện tử OHYO, chiều dài và đƣờng kính bằng thƣớc kẹp
3.4.2 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan
a. Phương pháp pha loãng
Mục ch Xác ịnh ngưỡng cảm phân biệt trước và sau khi sử dụng bột quả thần kỳ.
Nƣớc cà phê (Trung Nguyên)
Bổ sung bột quả thần kỳ và đƣờng
E1 E2 E3 E4 E5
Chuẩn bị mẫu: Mẫu đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp pha loãng. Trong đ yêu cầu nồng độ chất thử cao nhất phải lớn hơn nhiều so với ngƣ ng cảm phân biệt trung bình (Larmond, 1970). Các mẫu chứa 4 vị: chua (acid citric , đắng (caffein), mặn (NaCl), ngọt (sucrose) đƣợc bố tr nhƣ Bảng 3.1.
Bảng 3.2 Bảng chuẩn bị mẫu cho 4 vị cơ bản
Mẫu f1 f2 f3 f4 f5 f6 f7 f8 f9 f10
Nồng độ acid citric (g/l) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1
Nồng độ caffein (g/l) 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2
Nồng độ NaCl (g/l) 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9
Nồng độ sucrose (g/l) 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Với 5 mẫu bột quả thần kỳ theo nồng độ chất bổ sung tăng dần (10%, 15%, 20 , 25 , 30 trong đ mỗi mẫu sẽ đƣợc bố trí với 4 mức tỷ lệ bột hòa tan để cho cảm quan viên dùng mẫu đánh giá cảm quan vị.
Bảng 3.3 Bảng pha mẫu bột quả thần kỳ để đánh giá trên vị Nồng độ Mẫu bột C0 C1 C2 C3 10% 0 g/10 ml 0,25 g/10 ml 0,5 g/10 ml 0,75 g/10 ml 15% 0 g/10 ml 0,5 g/10 ml 0,75 g/10 ml 1 g/10 ml 20% 0 g/10 ml 0,75 g/10 ml 1 g/10 ml 1,25 g/10 ml 25% 0 g/10 ml 1 g/10 ml 1,25 g/10 ml 1,5 g/10 ml 30% 0 g/10 ml 2 g/10 ml 2,5 g/10 ml 3 g/10 ml
Tiến hành: Hội đồng gồm 20 thành viên, mỗi ngƣời sẽ đƣợc nhận mẫu đầu tiên đƣợc đánh dấu là mẫu C chứa dung dịch quả thần kỳ nhƣ bố trí theo Bảng 3.2. Các thành viên cảm quan sẽ đƣợc thử mẫu C trƣớc, sau đ đợi khoảng 5 đến 10 phút sẽ thử lần lƣợt đến các mẫu có chứa vị theo thứ tự tăng dần từ thấp đến cao, không thử lại các mẫu đã thử qua. Đến khi tình nguyện viên phân biệt đƣợc chính xác vị của dung dịch thì quá trình kiểm tra kết thúc và nồng độ tại đ tình nguyện viên phân biệt ra vị cơ bản ch nh là ngƣ ng cảm phân biệt của tình nguyện viên. Mỗi lần tham gia các tình nguyện viên chỉ đƣợc kiểm tra 1 vị cơ bản và chỉ đƣợc thử trƣớc 1 nồng độ bột quả thần kỳ.
b. Phương pháp mô tả ịnh lượng QDA (Quantitative Descriptive Analysis)
Phƣơng pháp mô tả là một trong những công cụ tinh vi trong kho tàng khoa học cảm quan, nó bao gồm việc phát hiện và mô tả cả về chất lƣợng lẫn số lƣợng về các chỉ tiêu cảm quan của thực phẩm nhƣ mùi, vị, hình thái, cấu trúc và màu sắc của thực phẩm.
Các thành viên trong hội đồng đánh giá cảm quan sẽ xây dựng và phát triển