Tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết từ 20 mg mẫu cơ của từng cá thể cá bằng bộ kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục A). DNA sau khi tách chiết được bảo quản trong tủ đông – 400C.
Tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µL bao gồm 2,5 µL Dream Taq Buffer (1X); 5 µL mẫu DNA; 1 µL mỗi mồi (10 µM); 0,5 µL dNTP (10 µM); 0,125 µL Dream Taq Polymerase (5 U/µL) và thêm H2O cho đủ thể tích. Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng khuếch đại đoạn gen 16S của DNA ty thể và giải trình tự
là 16Sar (5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) và 16Sbr (5’-
CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’) (Palumbi và ctv, 1991). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: Giai đoạn biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút; sau đó là 38 chu kỳ của 94oC trong 30 giây, nhiệt độ lai 48oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 7 phút (Hình 2.6).
Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 16S mtDNA
Điện di kiểm tra kết quả
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % nhuộm Ethidium bromide
Chuẩn bị gel agarose 1,5 % : Cân 0,6 g agarose rồi cho vào 40 mL đệm TBE 1X
chứa trong bình tam giác 100 mL thứ nhất, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 700C rồi chuyển qua bình tam giác 100 mL thứ hai. Thêm 1,5 µL Ethidium bromide, lắc nhẹ để tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác). Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược. Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh rách các giếng.
Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản
gel. Dùng micropipette trộn đều 3 µL mẫu với 1 µL loading dye 6X, rồi bơm vào các giếng của gel. Hút 3 µL DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng. Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90 V, 400 mA trong 20 phút.
Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và xem
các band DNA dưới tia cực tím, sản phẩm của quá trình khuếch đại là các band có kích thước vào khoảng 650 bp.
Giải trình tự DNA
Các mẫu DNA sau khi thực hiện phản ứng PCR được gửi đến công ty Nam Khoa (Nam Khoa Biotek Company, Hồ Chí Minh, Việt Nam) để giải trình tự.
Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi
tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây, cuối cùng là 60oC trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems).