2.1.1 Sắn
Sắn được lấy từ nhà máy rượu Thanh Ba – Phú Thọ với các chỉ tiêu nguyên liệu ban đầu như sau: hàm lượng tinh bột 65 - 67%, độ ẩm khoảng 14%.
2.1.2 Gạo
Gạo được mua tại cửa hàng gạo ở chợ Mơ, với các chỉ tiêu cần đạt được là hàm lượng tinh bột lớn hơn 70%, độ ẩm dưới 14%, không bị mối mọt.
2.1.3 Enzim
Enzim sử dụng trong nghiên cứu bao gồm những enzim sau: Enzim dịch hoá: Termamyl SC – NOVO, Đan Mạch.
Spezyme Extra – Genencor, Mỹ. Enzim đường hoá: Dextrzyme GA – NOVO, Đan Mạch.
Distillase L-400 –Genencor, Mỹ.
Enzim thuỷ phân tinh bột sống: Stargen 001– Genencor, Mỹ. 2.1.4 Nấm men
Nấm men sử dụng trong nghiên cứu là nấm men khô của công ty Mauri – La Ngà, Đồng Nai, Việt Nam, nấm men có đặc điểm sau:
Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisae.
Nhiệt độ tối ưu: 28 – 32oC.
24 2.1.5 Hoá chất
Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất cơ bản (NaOH, H2SO4, K3Fe(CN)6...), có độ tinh khiết phân tích, có sẵn trong phòng thí nghiệm trung tâm của Công ty Cổ phần Cồn Rượu Hà Nội.
2.1.6 Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ thường sử dụng trong phòng thí nghiệm: ống nghiệm, bình tam giác, pipet...
Chiết quang kế. Máy đo pH cầm tay.
Máy đo cồn cầm tay, để bàn. Cồn kế. Bộ cất cồn. Tủ ấm. Bếp điện. Cân điện tử. 2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.2.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy
Nguyên tắc: Tách ẩm ra khỏi nguyên liệu bằng cách sấy ở 100 – 105oC đến khối lượng không đổi.
Cách tiến hành: Cân khoảng 5 gam bột đã nghiền nhỏ trong hộp nhôm đã biết trọng lượng. Mở nắp và đặt hộp nhôm vào tủ sấy có nhiệt độ 105oC, sau 3 giờ sấy đậy nắp và làm nguội trong bình hút ẩm, sau đó cân lại, ghi số cân. Sấy tiếp 30
25
– 60 phút. Sau đó đem làm nguội và cân lại lần 2. Nếu sai số hai lần không quá 0,001g thì xem như quá trình tách nước kết thúc.
Độ ẩm của nguyên liệu (%)được tính theo công thức: 100 1 2 1 m m m W , % (m/m) Trong đó:
m1 - khối lượng mẫu trước khi sấy (g); m2 - khối lượng mẫu sau khi sấy (g).
2.2.2 Xác định hàm lượng chất khô
Xác định theo phương pháp hoá lý dùng chiết quang kế. 2.2.3 Đo pH
Đo pH theo phương pháp hoá lý bằng pH meter.
2.2.4 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Graxianop
Nguyên tắc: Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm cùng với ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thành axit đường. Dùng xanh metylen xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc. Phản ứng chính như sau:
2K3Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO to 2K4Fe(CN)6 + 2H2O + COOH(CHOH)4COOH
Cách tiến hành: Dùng pipet lấy đúng 20 ml dung dịch ferixyanua kali cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vào đó 5 ml dung dịch KOH 2,5N và 3 – 4 giọt metylen (nếu nồng độ dịch đường thấp hơn 0,25% thì lấy 10 ml ferixyanua kali và 2,5 ml dung dịch KOH). Lắc nhẹ và đặt trên bếp điện hoặc bếp ga, đun sao cho sau 1 – 2 phút thì sôi. Tiếp đó dùng dung dịch đường loãng để chuẩn tới mất màu của xanh metylen. Chú ý màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang phớt hồng và cuối cùng là vàng da cam thì kết thúc.
26
Hàm lượng đường có trong dịch pha loãng được tính như sau: 1000 m f a D (g/l) Trong đó:
a: lượng đường glucoza chứa trong m (ml) dịch pha loãng và tương ứng với 20 ml Ferixyanua kali.
F: hệ số pha loãng. 1000: hệ số quy đổi ra lít.
Xác định hệ số a ta làm như sau: Cân 0,5g đường glucoza tinh khiết pha thành 100ml để thu đường dịch đường có nồng độ 0,5%. Lấy dung dịch này làm dung dịch chuẩn, chuẩn 20ml ferixyanua. Hệ số a được tính bằng ao.0,005 (ao là số ml dịch đường chuẩn vừa xác định).
2.2.5 Xác định thành phần dịch đường bằng sắc ký lỏng cao áp
Xác định theo phương pháp hoá lý bằng máy sắc ký lỏng cao áp (Dionex Summit, Mỹ). Đường được phân tách bằng cột Aminex HPX-87P (Biorad, CA, Mỹ). Nhiệt độ cột phân tích là 80°C và pha động sử dụng là nước với vận tốc dòng 0,6 ml/phút. Thời gian phân tích 1 mẫu là 20 phút và kết quả phân tích được xử lý trên phần mềm Chromelon (Dionex, Mỹ) [22].
2.2.6 Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng HCl Nguyên tắc: Thuỷ phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 2% ở điều Nguyên tắc: Thuỷ phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 2% ở điều kiện đun sôi trong bình cách thuỷ trong thời gian 2 giờ. Dịch đã thuỷ phân được làm nguội và trung hoà bằng NaOH với chỉ thị methyl da cam. Hàm lượng đường trong dung dịch được xác định theo phương pháp xác định Graxianop.
Cách tiến hành: Cân khoảng 2g bột rồi chuyển toàn bộ vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 250 ml. Tiếp theo cho thêm 100 ml HCl 2% (100 ml nước cất cộng thêm 6 ml HCl 35%), đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí. Lắc
27
nhẹ rồi đặt nồi vào đun cách thuỷ, đun tới sôi và cho sôi khoảng 2 giờ. Mức nước ở nồi cách thuỷ phải luôn cao hơn mức nước trong bình thuỷ phân, phải chuẩn bị nước sôi để bổ sung vào. Sau hai giờ thuỷ phân, toàn bộ lượng tinh bột đã chuyển hoá thành glucoza, làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm 4 – 5 giọt metyl da cam, dùng NaOH 10% để trung hoà axit tới đổi màu. Chú ý chỉ trung hoà khi đã làm nguội đến 30oC, vì ở nhiệt độ cao và kiềm cục bộ thì glucoza sẽ bị phân huỷ làm kết quả thiếu chính xác. Trung hoà xong ta chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 250 ml, tráng bình rồi thêm nước cất tới ngấn bình và đem lọc.
Tiếp đó xác định hàm lượng đường trong dịch đường thu được theo phương pháp Graxianop.
Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu TB (%) được tính theo công thức:
9 , 0 100 m b b a TB , % Trong đó:
a - số gam glucoza tương ứng với 20 ml ferixyanua kali; b - số mililít dịch đường loãng tiêu hao khi định phân; m - số gam bột ở mẫu thí nghiệm;
0,9 - hệ số chuyển glucoza thành tinh bột. 2.2.7 Xác định độ rượu trong giấm chín
Cách tiến hành: Lấy 100 ml dịch lọc giấm chín có nhiệt độ xấp xỉ 20oC cho vào bình định mức 100 ml, rót dịch giấm vào bình cất rồi tráng bình bằng 100 ml nước cất rồi cũng đổ vào bình cất 1 có dung tích khoảng 500 ml.
Nối bình với hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất cho tới khi nước ngưng ở bình 2 còn 2 – 3 ml nữa thì đầy tới ngấn 100 ml. Cất xong đặt bình 2 vào nồi điều nhiệt và giữ ở nhiệt độ 20oC (cùng nhiệt độ khi lấy dịch giấm).
28
Sau 10 đến 15 phút thêm nước cất tới ngấn bình, đậy kín và chuẩn bị đo nồng độ rượu trong dung dịch bằng máy đo cồn cầm tay hoặc sử dụng cồn kế.
29
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT LÊN MEN Hiệu suất lên men được tính theo công thức sau: Hiệu suất lên men được tính theo công thức sau:
LM= Ta có:
Quá trình thủy phân tinh bột thành đường theo phương trình sau: (C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6 (1)
162 180
Quá trình lên men đường thành rượu xảy ra theo phương trình sau: C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 (2)
180 92 88 Từ phương trình (2) ta thấy:
Cứ 180 g đường glucoza cho ta 92 g cồn etylic
Vậy ứng với 100 g đường glucoza sẽ cho ta x (g) cồn êtylic x = 180 100 . 92 = 51,11 (g) Ở 20oC tỷ trọng của cồn là: d420 = 0,79 Vậy tương ứng với 51,11 (g) cồn là:
79 , 0 11 , 51 = 64,76 ml cồn.
Từ phương trình (1) ta có: Hệ số chuyển đổi tinh bột thành đường là:
162 180
= 1,11
Vậy cứ 100 g tinh bột sẽ cho ta 64,767. 1,11 = 71,945 72 ml cồn. Tóm lại hiệu suất lên men được tính theo công thức sau:
Lượng cồn chứa trong giấm chín Lượng cồn tính theo lý thuyết
30 72 , 0 b m c a LM , (%) Trong đó:
a: lượng cồn chứa trong giấm chín (g) c: nồng độ cồn trong giấm chín (%V) m: lượng nguyên liệu (g)
b: hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu (%) 0,72: hệ số chuyển tinh bột thành cồn
31
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU
Trước khi tiến hành các nghiên cứu, nguyên liệu chính sử dụng trong quá trình sản xuất cồn được phân tích để xác định chất lượng. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu chính của nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thành phần nguyên liệu Nguyên liệu Chỉ tiêu Sắn Gạo Hàm lượng tinh bột (%) 67% ± 3,5 71,5% ± 2,7 Độ ẩm (%) 14,1% ± 0,5 10,9% ± 1
Kết quả nhận được cho thấy sắn lát và gạo dùng trong sản xuất cồn đạt chỉ tiêu chất lượng cho sản xuất cồn theo quy định của các nhà máy đang sử dụng hiện nay.
3.2 ỨNG DỤNG HỆ ENZIM THỦY PHÂN TINH BỘT SỐNG Ở NHIỆT ĐỘ THƯỜNG (Stargen 001) TRONG QÚA TRÌNH SẢN XUẤT CỒN TỪ GẠO THƯỜNG (Stargen 001) TRONG QÚA TRÌNH SẢN XUẤT CỒN TỪ GẠO
Rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng hệ enzim thuỷ phân tinh bột sống trong quá trình sản xuất cồn từ nguyên liệu gạo và ngô. Tuy nhiên đối với mỗi loại nguyên liệu khác nhau thì khả năng hoạt động của enzim lại khác nhau và điều kiện xử lý nguyên liệu ban đầu cũng khác nhau [30]. Như vậy khả năng ảnh hưởng của nguyên liệu đến hoạt động của enzim khá rõ rệt. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ứng dụng của enzim này trên nguyên liệu gạo và sắn của Việt Nam.
32
3.2.1 Khảo sát quy trình công nghệ sản xuất cồn của nhà máy Rượu Hà Nội Để có thể so sánh hiệu quả của enzim mới này trên gạo của nước ta, trước Để có thể so sánh hiệu quả của enzim mới này trên gạo của nước ta, trước tiên chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình sản xuất cồn từ gạo theo công nghệ của nhà máy rượu Hà Nội, một trong những nhà máy sản xuất cồn hàng đầu của Việt Nam. Quy trình công nghệ được thể hiện ở hình 3.1. Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.2.
Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất cồn từ gạo theo công nghệ của nhà máy Rượu Hà Nội Mô tả qui trình: Gạo được cấp vào thiết bị nghiền bột. Bột được nghiền nhỏ và phải lọt qua rây có đường kính d=1,2mm mới được cấp vào nồi nấu bột. Tại nồi nấu, bột và nước được cấp vào theo tỉ lệ bột là 25% (một phần bột và ba phần nước). Đây là tỉ lệ nấu tối ưu được sử dụng để vừa đạt được sự tối ưu về thiết bị cũng như kết quả lên men cuối cùng có hàm lượng đường sót và tinh bột sót thấp
100% lọt qua rây d =1,2mm
Nồng độ dịch bột: 25%, pH = 5-6 Termamyl SC: 0,033%
90oC trong 30 phút; đun sôi 30 phút 65oC, bổ sung thuốc sát trùng (0,0025% ) 60oC, bổ sung GA với tỷ lệ 0,03% Giữ 1 giờ Nhiệt độ 30oC Urê: 0,025% Nấm men: 0,032% Gạo Nghiền Nấu Đường hoá Lên men Chưng cất
33
nhất. Trước khi cấp bột vào thùng người ta hòa một lượng nhỏ enzim Termamyl SC với nước để lót đáy sau đó quá trình cấp bột mới được bắt đầu. Kết thúc quá trình cấp bột lượng enzim được bổ sung theo đúng tỉ lệ là o,033%. Nhiệt độ của thùng nấu luôn được duy trì là 90oC trong 30’, pH luôn ở trong khoảng 5-6. Sau đó thùng nấu được đun sôi 30’ rồi chuyển sang thùng đường hóa. Khi nhiệt độ thùng đường hóa đạt 65oC thì bổ sung thuốc sát trùng theo tỉ lệ 0,0025%, xuống đến 60oC thì bổ sung enzim đường hóa Dextrzyme GA theo tỉ lệ 0,03%. Quá trình đường hóa được giữ trong khoảng 1h rồi mới chuyển sang thùng lên men. Nấm men được đánh tan rồi đổ vào thùng lên men trước khi cấp dịch đường hóa. Tỉ lệ nấm men được bổ sung là 0,032%. Nhiệt độ thùng lên men luôn được duy trì 30-32oC. Ure bổ sung theo tỉ lệ 0,025%. Tùy theo yêu cầu mà quá trình lên men được giữ trong thùng lâu hay mau. Thời gian lên men có thể để từ 96-120h. Sau đó dịch lên men được chuyển sang chưng cất.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát công nghệ sản xuất cồn của nhà máy Rượu Hà Nội
Chỉ tiêu Các quá trình
Dịch hoá Đường hoá Lên men
Nồng độ chất khô (oBx) 19,8 20,2 6,0
Lượng đường khử (g/l) 33,3 78,5 1,8
Độ rượu trong giấm chín (%V) - - 11,2
Lượng CO2 thoát ra (g/l) - - 85,6
Hiệu suất lên men (%) - - 87,0
Số liệu thu được ở bảng 3.2 cho thấy: nồng độ cồn trong giấm chín đạt 11,2%V, hiệu suất lên men đạt 87%. Quá trình lên men mạnh trong 96 giờ đầu và vẫn tiếp tục lên men trong khoảng thời gian tiếp theo. Độ rượu trong giấm chín đạt 11,2%V sau khoảng 120 giờ. Theo công bố của nhà máy Rượu Hà Nội, hiệu suất
34
lên đạt từ 87÷90%, độ rượu trong giấm chín từ 10÷11%V. Như vậy kết quả thu được ở bảng 3.2 có thể sử dụng làm kết quả so sánh cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2 Động học quá trình thuỷ phân tinh bột gạo bởi enzim Stargen 001
Hiện nay tại các nhà máy sản xuất cồn, tinh bột đều được nấu ở nhiệt độ cao để chuyển thành trạng thái hoà tan cho enzim thuỷ phân tinh bột dễ hoạt động. Tuy nhiên enzim Stargen 001 có thể thuỷ phân trực tiếp tinh bột sống thành đường khử ngay ở nhiệt độ thường. Do vậy trước khi thực hiện quá trình lên men chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt động của enzim Stargen 001 trên tinh bột gạo ở nhiệt độ thường (30oC).
Mẫu thí nghiệm được chuẩn bị như sau: bột gạo được hoà trộn với nước để đạt được nồng độ dịch bột là 25%. Hỗn hợp được điều chỉnh pH về giá trị 4,5. Sau đó enzim Stargen 001 được bổ sung với liều lượng: 2,5 kg/ tấn chất khô. Quá trình thuỷ phân diễn ra ở 30oC trong điều kiện 2 – 3 giờ khuấy trộn 2 – 3 phút [29, 30]. Trong quá trình thuỷ phân, mẫu được lấy ra để phân tích hàm lượng đường khử, chất hoà tan và thành phần các chất hoà tan trong dịch. Kết quả động học thuỷ phân tinh bột gạo bởi enzim Stargen 001 được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2 Động học quá trình thuỷ phân tinh bột gạo bởi enzim Stargen 001 0 2 4 6 8 10 12 14 0 10 20 30 40 50 60
Thời gian (giờ)
L ư ợ n g c h ấ t h o à t a n ( g ) Bx Đường khử
35
Từ đồ thị 3.2 chúng ta thấy tại các thời điểm khác nhau hàm lượng đường khử tạo ra tương đương với hàm lượng chất khô hoà tan có trong hỗn hợp. Điều này chứng tỏ đường khử là thành phần chủ yếu của các chất hoà tan trong dịch. Điều này tiếp tục được khẳng định khi chúng tôi tiến hành phân tích đồng thời thành phần các chất có trong dịch đường được thuỷ phân bởi enzim Stargen 001 và dịch đường được thuỷ phân bởi hai enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ cao là Termamyl SC và Dextrozyme GA theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (Hình 3.3 và Hình 3.4).
Kết quả thu được từ sắc ký đồ cho thấy với quá trình thuỷ phân tinh bột sử dụng enzim dịch hoá Termamyl và enzim đường hoá Dextrozyme GA thì quá trình dịch hoá và đường hoá ban đầu tạo ra hỗn hợp dextrin và oligosaccarit phân tử lượng cao và chỉ có một lượng nhỏ glucoza và mantoza được tạo ra. Tuy nhiên khi thuỷ phân tinh bột bằng enzim Stargen 001 thì thành phần dịch đường tại các thời điểm khác nhau chỉ gồm đường maltoza và glucoza. Điều này hoàn toàn phù hợp với cơ chế hoạt động của hỗn hợp α-amylase và glucoamylase trong chế phẩm