Chưng cất là quá trình tách rượu và các tạp chất bay hơi ra khỏi dấm chín. Giấm chín là sản phẩm sau quá trình lên men bao gồm: các chất dễ bay hơi như rượu, este và một số alcol có số nguyên tử cacbon lớn hơn 2 và một lượng nhỏ tinh bột, đường, dextrin…
Chất lượng của cồn thành phẩm phụ thuộc nhiều vào quá trình chưng cất và tinh chế. Để loại được tạp chất đòi hỏi hệ thống phải có những tháp cất tốt.
Quá trình tinh chế là quá trình tách các tạp chất khỏi cồn thô và nâng cao độ cồn. Sản phẩm của cồn tinh chế có độ cồn trong khoảng 90 – 96% thể tích.
1.3.2 Một số tiến bộ trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột
Quy trình sản xuất cồn theo phương pháp truyền thống vẫn được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới và Việt Nam. Tuy nhiên phương pháp này vần có nhiều nhược điểm như:
Nấu ở nhiệt độ cao nên gây tổn thất đường do tinh bột bị cháy và biến đổi thành đường không lên men được. Ngoài ra, nấu ở nhiệt độ cao đòi hỏi những thiết bị phức tạp gồm bộ phận cấp hơi, làm lạnh…Do đó sẽ tốn vật liệu chế tạo thiết bị.
Độ nhớt của dịch cháo trong quá trình nấu rất cao do vậy cánh khuấy phải hoạt động với cường độ cao.
Nồng độ đường trong dịch đường trước khi lên men cao nên nấm men phải chịu áp suất thẩm thấu cao, ảnh hưởng tới sự phát triển và khả năng lên men của nấm men dẫn đến hiệu suất lên men thấp.
Đặc biệt, quá trình nấu ở nhiệt độ cao tiêu tốn nhiều năng lượng: tiêu tốn khoảng từ 10-15% tổng lượng năng lượng trong toàn bộ quá trình sản xuất cồn (tuỳ thuộc vào nhiệt độ của quá trình nấu) (Hình 1.5) [11].
18 0 10 20 30 40 50 60 70 % Nghiền Nấu, đường hoá
Lên men Chưng cất
Tinh chế
Hinh 1.5 Phân bố tiêu thụ năng lượng trong quá trình sản xuất cồn từ tinh bột
Qua biểu đồ đồ này chúng ta cũng nhận thấy rõ giai đoạn chưng cất tiêu tốn rất nhiều năng lượng, chiếm tới gần 70% năng lượng cung cấp cho toàn bộ quá trình sản xuất cồn. Tuy nhiên công nghệ màng thấm-bay hơi (pervaporation) có thể tách được hơn 95% etanol trong quá trình lên men mà không cần tới quá trình chưng cất. Việc tinh chế loại bỏ tạp chất để thu được cồn cao độ chỉ cần thực hiện ở nhiệt độ thường (30oC). Ngoài ra khi sử dụng màng thấm-bay hơi, cồn được tách ra liên tục trong quá trình lên men nên không gây ảnh hưởng của nồng độ cồn tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men [14]. Đó là một cải tiến mới trong quá trình chưng cất còn trong quá trình lên men cũng có nhiều nghiên cứu đáng quan tâm. Phương pháp cố định tế bào nấm men được ứng dụng khá phổ biến trên thế giới, các tế bào nấm men được nuôi cấy và được giam giữ trong một không gian phản ứng mà vẫn giữ được tính chất xúc tác của chúng và làm cho chúng được tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục để tạo ra sản phẩm. Ngoài phương pháp này còn có một số phương pháp khác như: lên men liên tục tái sử dụng tế bào hay tái sử dụng tế
19
bào với hệ thống chân không. Và hiện nay đang có một hướng nghiên cứu rất mới lạ. Đó là ứng dụng nấm men có hệ enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thường vào quá trình sản xuất cồn [19]. Khi nghiên cứu thành công, quá trình sản xuất cồn sẽ trở nên vô cùng đơn giản và không cần tới các enzim thuỷ phân tinh bột. Việc áp dụng hệ enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thấp đã mang lại khá nhiều thành công cho quá trình sản xuất cồn ở một số nước trên thế giới. Đặc biệt khi sử dụng hệ enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thường quá trình sản xuất cồn chỉ còn thực hiện ở 30oC, các thiết bị nấu đường hoá được loại bỏ (Hình1.6), quá trình sản xuất cồn thực hiện quá trình đường hoá lên men đồng thời, rút ngắn thời gian sản xuất.
Hình 1.6 Sơ đồ công nghệ sản xuất cồn sử dụng enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thường (Stargen 001)
Ứng dụng hệ enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thường cũng như hệ enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thấp trên nguyên liệu của Việt Nam sẽ là một hướng đi phù hợp cho ngành sản xuất cồn của nước ta trong thời kỳ đổi mới cải tiến công nghệ như hiện nay [3]. Trước khi áp dụng hệ enzim thuỷ phân tinh bột này, chúng ta sẽ tìm hiểu các đặc tính nổi bật của hệ enzim này.
20
1.4 CÁC ENZIM THỦY PHÂN TINH BỘT Ở NHIỆT ĐỘ KHÔNG CAO 1.4.1 Hệ enzim thuỷ phân tinh bột sống ở nhiệt độ thường (Stargen 001) 1.4.1 Hệ enzim thuỷ phân tinh bột sống ở nhiệt độ thường (Stargen 001)
Stargen 001 là một hỗn hợp α-amylaza và glucoamylaza được thu nhận từ
hai chủng nấm mốc Aspergillus kawachi và Aspergillus niger. Hỗn hợp enzim có
pH tối ưu nằm trong khoảng 4,0 - 4,5. Chúng có khả năng thuỷ phân tinh bột chưa hồ hoá ở nhiệt độ thường (30oC), giải phóng trực tiếp ra đường glucoza [26, 27].
Đã có khá nhiều nghiên cứu về khả năng thủy phân tinh bột sống của hệ
enzim amylaza như amylaza từ chủng Lactobacillus amylovorus có thể hấp thụ lên
bề mặt hạt tinh bột khoai tây và thủy phân chúng; hay amyloglucosidaza của
Aspergillus awamori cũng có khả năng hấp phụ trên bề mặt hạt tinh bột và cắt liên
kết nhánh; hay Aspergillus Spezyme Extra.K-27 sản xuất một hệ α-amylaza và GA ngoại bào tác dụng đồng thời lên tinh bột ngô và tinh bột khoai tây sống. Khác với các enzim thủy phân tinh bột đã hồ hóa, enzim thủy phân tinh bột sống hoạt động theo cơ chế hấp phụ trên bề mặt hạt tinh bột và tấn công hạt tinh bột bằng cách tạo nhiều lỗ trên bề mặt hạt. Tuy nhiên khả năng thủy phân tinh bột sống phụ thuộc vào nguồn tinh bột và enzim. Sự liên kết giữa hai thành phần amylose, amylopectin và cấu trúc tinh thể là những yếu tố ảnh hưởng tới khả năng thủy phân tinh bột sống của amylaza. Khi hàm lượng amyloza trong hạt tinh bột càng cao thì khả năng thuỷ phân tinh bột sống của amylaza càng kém [5, 18]. Quan sát trên kính hiển vi điện tử ta có thể thấy được một phần cơ chế tấn công và thủy phân hạt tinh bột gạo sống
(Hình 1.7). Glucoamylaza từ A. niger tấn công hạt tinh bột theo diện rộng bằng cách tạo nhiều lỗ nhỏ, còn α-amylaza từ chủng nấm mốc A. kawachi lại có xu hướng tạo
những lỗ lớn và sâu trên bề mặt hạt tinh bột. Đặc biệt khi kết hợp cả hai enzim trên trong chế phẩm enzim Stargen 001 thì hiệu quả thủy phân tinh bột tốt hơn hẳn. Hạt tinh bột bị “khoan” sâu và rộng hơn [27, 13].
Hiện nay chế phẩm thủy phân tinh bột sống (Stargen 001) của hãng Genencor đang được sử dụng rất rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất cồn của Mỹ. Chế phẩm này đã được ứng dụng rất thành công trên nguyên liệu gạo, lúa mỳ
21
và ngô. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt động của enzim Stargen 001 trong quá trình sản xuất cồn từ hai nguyên liệu chính của Việt Nam là gạo và sắn lát.
Hình 1.7 Hạt tinh bột gạo chưa hồ hóa bị thủy phân bởi amylaza
Ngoài chế phẩm enzim thuỷ phân có khả năng thuỷ phân tinh bột sống ở nhiệt độ thường, hãng Genencor còn đưa ra một số enzim nấu đường hoá ở nhiệt độ thấp và không cần quá trình đun sôi. Ứng dụng hệ enzim nấu đường hoá này sẽ giảm được một phần chi phí năng lượng cho quá trình sản xuất cồn.
1.4.2 Enzim thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ thấp
Enzim dịch hoá ở nhiệt độ không cao (Spezyme Extra) là một α-amilaza chịu
nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn B. licheniformic thuỷ phân hiệu quả liên kết α-1,4
glucozit thành các dextrin và oligosaccarit; do đó làm giảm độ nhớt của dịch bột một cách nhanh chóng. Spezyme Extra có khả năng thuỷ phân tinh bột ở nhiệt độ 70 - 75oC [28].
Distillase L-400 là một glucoamylaza có nguồn gốc từ nấm mốc. Distillase có tác dụng thuỷ phân các nối kết α-1,4 và 1,6-D glucozit của tinh bột đã được dịch
A: α-amylaza từ chủng nấm mốc
A. kawachi
B: glucoamylaza từA. niger
A+B: hỗn hợp α-amylaza và glucoamylaza
22
hoá. Điều kiện tối ưu cho enzim hoạt động là nhiệt độ 60-62oC và pH = 4,0 - 4,5 [29].
Hệ enzim nấu đường hoá này đã được ứng dụng trong quá trình sản xuất cồn từ sắn của Thái Lan [11]. Do vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hệ enzim vào quá trình sản xuất cồn từ sắn của Việt Nam.
23
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Sắn 2.1.1 Sắn
Sắn được lấy từ nhà máy rượu Thanh Ba – Phú Thọ với các chỉ tiêu nguyên liệu ban đầu như sau: hàm lượng tinh bột 65 - 67%, độ ẩm khoảng 14%.
2.1.2 Gạo
Gạo được mua tại cửa hàng gạo ở chợ Mơ, với các chỉ tiêu cần đạt được là hàm lượng tinh bột lớn hơn 70%, độ ẩm dưới 14%, không bị mối mọt.
2.1.3 Enzim
Enzim sử dụng trong nghiên cứu bao gồm những enzim sau: Enzim dịch hoá: Termamyl SC – NOVO, Đan Mạch.
Spezyme Extra – Genencor, Mỹ. Enzim đường hoá: Dextrzyme GA – NOVO, Đan Mạch.
Distillase L-400 –Genencor, Mỹ.
Enzim thuỷ phân tinh bột sống: Stargen 001– Genencor, Mỹ. 2.1.4 Nấm men
Nấm men sử dụng trong nghiên cứu là nấm men khô của công ty Mauri – La Ngà, Đồng Nai, Việt Nam, nấm men có đặc điểm sau:
Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisae.
Nhiệt độ tối ưu: 28 – 32oC.
24 2.1.5 Hoá chất
Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất cơ bản (NaOH, H2SO4, K3Fe(CN)6...), có độ tinh khiết phân tích, có sẵn trong phòng thí nghiệm trung tâm của Công ty Cổ phần Cồn Rượu Hà Nội.
2.1.6 Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ thường sử dụng trong phòng thí nghiệm: ống nghiệm, bình tam giác, pipet...
Chiết quang kế. Máy đo pH cầm tay.
Máy đo cồn cầm tay, để bàn. Cồn kế. Bộ cất cồn. Tủ ấm. Bếp điện. Cân điện tử. 2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.2.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy
Nguyên tắc: Tách ẩm ra khỏi nguyên liệu bằng cách sấy ở 100 – 105oC đến khối lượng không đổi.
Cách tiến hành: Cân khoảng 5 gam bột đã nghiền nhỏ trong hộp nhôm đã biết trọng lượng. Mở nắp và đặt hộp nhôm vào tủ sấy có nhiệt độ 105oC, sau 3 giờ sấy đậy nắp và làm nguội trong bình hút ẩm, sau đó cân lại, ghi số cân. Sấy tiếp 30
25
– 60 phút. Sau đó đem làm nguội và cân lại lần 2. Nếu sai số hai lần không quá 0,001g thì xem như quá trình tách nước kết thúc.
Độ ẩm của nguyên liệu (%)được tính theo công thức: 100 1 2 1 m m m W , % (m/m) Trong đó:
m1 - khối lượng mẫu trước khi sấy (g); m2 - khối lượng mẫu sau khi sấy (g).
2.2.2 Xác định hàm lượng chất khô
Xác định theo phương pháp hoá lý dùng chiết quang kế. 2.2.3 Đo pH
Đo pH theo phương pháp hoá lý bằng pH meter.
2.2.4 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Graxianop
Nguyên tắc: Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm cùng với ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thành axit đường. Dùng xanh metylen xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc. Phản ứng chính như sau:
2K3Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO to 2K4Fe(CN)6 + 2H2O + COOH(CHOH)4COOH
Cách tiến hành: Dùng pipet lấy đúng 20 ml dung dịch ferixyanua kali cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vào đó 5 ml dung dịch KOH 2,5N và 3 – 4 giọt metylen (nếu nồng độ dịch đường thấp hơn 0,25% thì lấy 10 ml ferixyanua kali và 2,5 ml dung dịch KOH). Lắc nhẹ và đặt trên bếp điện hoặc bếp ga, đun sao cho sau 1 – 2 phút thì sôi. Tiếp đó dùng dung dịch đường loãng để chuẩn tới mất màu của xanh metylen. Chú ý màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang phớt hồng và cuối cùng là vàng da cam thì kết thúc.
26
Hàm lượng đường có trong dịch pha loãng được tính như sau: 1000 m f a D (g/l) Trong đó:
a: lượng đường glucoza chứa trong m (ml) dịch pha loãng và tương ứng với 20 ml Ferixyanua kali.
F: hệ số pha loãng. 1000: hệ số quy đổi ra lít.
Xác định hệ số a ta làm như sau: Cân 0,5g đường glucoza tinh khiết pha thành 100ml để thu đường dịch đường có nồng độ 0,5%. Lấy dung dịch này làm dung dịch chuẩn, chuẩn 20ml ferixyanua. Hệ số a được tính bằng ao.0,005 (ao là số ml dịch đường chuẩn vừa xác định).
2.2.5 Xác định thành phần dịch đường bằng sắc ký lỏng cao áp
Xác định theo phương pháp hoá lý bằng máy sắc ký lỏng cao áp (Dionex Summit, Mỹ). Đường được phân tách bằng cột Aminex HPX-87P (Biorad, CA, Mỹ). Nhiệt độ cột phân tích là 80°C và pha động sử dụng là nước với vận tốc dòng 0,6 ml/phút. Thời gian phân tích 1 mẫu là 20 phút và kết quả phân tích được xử lý trên phần mềm Chromelon (Dionex, Mỹ) [22].
2.2.6 Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng HCl Nguyên tắc: Thuỷ phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 2% ở điều Nguyên tắc: Thuỷ phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 2% ở điều kiện đun sôi trong bình cách thuỷ trong thời gian 2 giờ. Dịch đã thuỷ phân được làm nguội và trung hoà bằng NaOH với chỉ thị methyl da cam. Hàm lượng đường trong dung dịch được xác định theo phương pháp xác định Graxianop.
Cách tiến hành: Cân khoảng 2g bột rồi chuyển toàn bộ vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 250 ml. Tiếp theo cho thêm 100 ml HCl 2% (100 ml nước cất cộng thêm 6 ml HCl 35%), đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí. Lắc
27
nhẹ rồi đặt nồi vào đun cách thuỷ, đun tới sôi và cho sôi khoảng 2 giờ. Mức nước ở nồi cách thuỷ phải luôn cao hơn mức nước trong bình thuỷ phân, phải chuẩn bị nước sôi để bổ sung vào. Sau hai giờ thuỷ phân, toàn bộ lượng tinh bột đã chuyển hoá thành glucoza, làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm 4 – 5 giọt metyl da cam, dùng NaOH 10% để trung hoà axit tới đổi màu. Chú ý chỉ trung hoà khi đã làm nguội đến 30oC, vì ở nhiệt độ cao và kiềm cục bộ thì glucoza sẽ bị phân huỷ làm kết quả thiếu chính xác. Trung hoà xong ta chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 250 ml, tráng bình rồi thêm nước cất tới ngấn bình và đem lọc.
Tiếp đó xác định hàm lượng đường trong dịch đường thu được theo phương pháp Graxianop.
Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu TB (%) được tính theo công thức:
9 , 0 100 m b b a TB , % Trong đó:
a - số gam glucoza tương ứng với 20 ml ferixyanua kali; b - số mililít dịch đường loãng tiêu hao khi định phân; m - số gam bột ở mẫu thí nghiệm;
0,9 - hệ số chuyển glucoza thành tinh bột. 2.2.7 Xác định độ rượu trong giấm chín
Cách tiến hành: Lấy 100 ml dịch lọc giấm chín có nhiệt độ xấp xỉ 20oC cho vào bình định mức 100 ml, rót dịch giấm vào bình cất rồi tráng bình bằng 100 ml nước cất rồi cũng đổ vào bình cất 1 có dung tích khoảng 500 ml.
Nối bình với hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất cho tới khi nước ngưng ở bình 2 còn 2 – 3 ml nữa thì đầy tới ngấn 100 ml. Cất xong đặt bình 2 vào nồi điều nhiệt và giữ ở nhiệt độ 20oC (cùng nhiệt độ khi lấy dịch giấm).
28
Sau 10 đến 15 phút thêm nước cất tới ngấn bình, đậy kín và chuẩn bị đo nồng độ rượu trong dung dịch bằng máy đo cồn cầm tay hoặc sử dụng cồn kế.