- Khi dịch chưa xảy ra
2.5.3.Phương pháp xác ựịnh hiệu giá virus (liều gây nhiễm 50% phôi gà: EID 50) của lô vacxin
Do virus Newcastle chủng Lasota có ựộc lực yếu nên chúng không gây chết phôi sau 96 giờ gây nhiễm hoặc chỉ gây xuất huyết nhẹ nên ựể xác ựịnh hiệu giá virus trong một liều vacxin Lasota, chúng tôi sử dụng phương pháp kiểm tra gián tiếp thông qua việc gây nhiễm virus trên trứng gà ấp 10 ngày tuổi và làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (Hemagglutination test Ờ phản ứng HA), xác ựịnh mỗi liều vacxin phải chứa ắt nhất 106EID50.
- Chuẩn bị trứng: trứng gà có phôi 10 ngày tuổi, soi trứng , chọn những phôi khoẻ mạnh, ựánh dấu buồng hơi, ựánh dấu vị trắ ựầu phôi, sát trùng bằng cồn 70o xung quanh vỏ trứng, sát trùng vị trắ buồng hơi, vị vắ tiêm ở ựầu phôi bằng cồn iod 5%.
- Chuẩn bị vacxin: Mẫu lấy theo TCVN 160 - 92 Vacxin thú y - Quy trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm (như phần 3.5.1).
- Tiến hành: thắ nghiệm ựược kiểm tra trên 3 lô vacxin, vacxin kiểm tra ựược pha bằng nước muối sinh lý, pha loãng theo cơ số 10 sao cho 0,1 ml huyễn dịch virus ban ựầu chứa 1 liều vacxin, pha loãng từ nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-8. Mỗi nồng ựộ pha loãng tiêm cho 5 phôi, mỗi phôi tiêm 0,1ml.
Sau khi tiêm, phôi ựược ấp tiếp ở 37oC, theo dõi phôi ở các thời ựiểm 24 giờ ựến 96 giờ. Kiểm tra, ghi lại và cho những phôi chết vào tủ lạnh 4oC . Sau 96 giờ cho toàn bộ số phôi sống vào tủ âm ở -40C trong 6 giờ ựể cho mạch máu co lạị
Làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (Hemagglutination test Ờ phản ứng HA).
Nguyên lý: Virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà do trên lớp vỏ protein bên ngoài virus có chứa kháng nguyên HN (Haemaggutination neuraminidaza) có khả năng dắnh kết các hồng cầu lại rồi sau ựó cắt ựứt các thụ thể hồng cầu ựể chúng lại rời nhau rạ Dựa vào ựặc tắnh sinh học này của virus, người ta làm phản ứng HA ựể kiểm tra hiệu giá của virus có trong vacxin và ựược tắnh theo công thức của Reed Muench.
Tắnh EID50 theo công thức của Reed Muench: LgEID50 = lgA + X lgf
A1 Ờ 50 X =
A1Ờ B1 Trong ựó:
X: Khoảng cách cân ựối
A: độ pha loãng virus gây nhiễm cận trên A1: Tỉ lệ % phôi chết trên 50%
B1: Tỉ lệ % phôi chết dưới 50% f: Bậc pha loãng của virus
- Chuẩn bị hồng cầu: Lấy 10 ml máu tim gà, bổ sung thêm 5 ml Citrat Natri 5% ựể chống ựông máụ Ly tâm ựể hồng cầu lắng xuống rồi gạn bỏ phần nước trong ở trên, giữ lại hồng cầụ Cho nước muối sinh lý vào ựể rửa, trộn ựều,
ly tâm, gạn bỏ phần nước trong và giữ lại hồng cầụ Tiến hành rửa bằng nước muối sinh lý 3 lần. Sau ựó dùng nước muối sinh lý pha loãng hồng cầu thành nồng ựộ 1%. Bảo quản ở nhiệt ựộ 2 Ờ 80C
- Chuẩn bị nước trứng chứa virus ựã ựược gây nhiễm từ nồng ựộ 10-1 ựến 10-8 ở trên: Sau khi trứng ựược gây nhiễm từ nồng ựộ 10-1 ựến 10-8 và ấp theo dõi ựến 96 giờ, tiến hành bảo quản trong tủ lạnh cho mạch máu co lại sau ựó dùng kéo bộc lộ buồng hơi ựể hút nước trứng.
Tiến hành phản ứng HA
từng giếng thắ nghiệm.
- Hút 25ộl nước muối sinh lý 1% cho vào những giếng ựối chứng.
- Cho vào tất cả các giếng thắ nghiệm và giếng ựối chứng 25ộl hồng cầu gà 1% ựã lắc ựềụ
đọc kết quả: Kết quả ựược ựọc qua kắnh chuẩn ựộ chuyên dụng hoặc bằng cách nhìn nghiêng tấm nhựa chuẩn ựộ.
- Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu ngưng kết thành những hạt lấm tấm màu ựỏ rải ựều ở ựáy giếng của ựĩa nhựa chuẩn ựộ.
- Phản ứng âm tắnh: Hồng cầu lắng xuống ựáy giếng và tập trung thành một cục máu tròn ựỏ ở chắnh giữa ựáy giếng.